超分辨率光学涨落成像

图1：展示了宽场(左)与SOFI(右)对比时的分辨率提升。图像显示了3T3成纤维细胞，其微管网络用量子点标记。左)原始宽场图像。右)二阶SOFI图像。SOFI的光学切片特性明显改善了图像对比度，如SOFI图像中移除了标记为字母“A”的焦外特征所示。采集时间：100秒(每张图像0.1秒)。比例尺10 μm。摘自Dertinger等(2012)。

引言

自超分辨率显微镜发展以来，光的衍射极限不再是分辨率的硬性限制，使我们能够分辨极其精细的亚细胞细节。然而，许多显著提高分辨率的技术对样品制备有特定要求，或者采集时间长，或者分析过程复杂。

超分辨率光学涨落成像(SOFI)是一种计算超分辨率技术，可为含有涨落荧光团的样本提供分辨率增益。SOFI以其简单、经济、高速和低光暴露量而著称，避免了基于定位的超分辨率技术(如STORM)在活细胞和固定细胞成像中的许多缺点，即长时间采集、高信噪比要求和特定的闪烁需求。

该技术基于荧光团产生的光相关性的统计评估，由Dertinger等人于2009年提出，此后取得了快速发展，包括引入了3D和多光谱成像的可能性。(Dertinger, 2010; Peeters等, 2010; Peeters等, 2017; Descloux等, 2018; Yi, Son and Weiss, 2018; Grußmayer等, 2019; Purohit等, 2019).

SOFI原理

SOFI 的基本原理是利用单个荧光团发出的光的相关性。当单个荧光团的发射随时间波动时，该单个荧光团发出的光在时间上将是相关的(统计上相似的)。无论该荧光团发出的光击中相机的哪个位置、检测到多少光，或者相邻的荧光团是否也在发射，这种情况都会发生。

图像中固有的相关性可以通过数学方法计算，SOFI分析揭示了图像中的这种相关性。照射到像素上的光越多、相关性越强，该像素在SOFI图像中就会越亮。背景光和焦外光等不相关信号源将被抑制，这提供了增强的分辨率和光学切片能力，如图1和图2所示.

此外，由于SOFI本质上是一种计算技术，它非常适合与其他计算技术(Descloux等, 2018)或超分辨率技术结合使用，例如STORM(Schidorsky等, 2018), SIM(Zhao等, 2017), 和PALM(Deschout等, 2017)。这突显了SOFI作为计算工具的多功能性。

SOFI 相对于其他超分辨率技术的优势包括其固有的光学切片能力和对焦外光的抑制。这有利于对样本内部进行成像，并能以相对较少的采集帧数生成重建的3D模型，这意味着它是一种高速超分辨率技术，已证明其时间分辨率可达80毫秒(Peeters等, 2017).

在最简单的情况下，SOFI比宽场成像提供1.4(√2)倍的分辨率提升，而高阶SOFI可达3到5倍的提升。这与提供2倍分辨率提升的SIM相比具有优势，尽管SIM的变体(如iSIM)能够提供更好的时间分辨率(York等, 2013; Curd等, 2015)。此外，SOFI的运行不需要高信噪比(SNR)图像。

SOFI 采集

SOFI 不需要特殊的样本制备，只需荧光团具有一定的随机时间依赖性波动即可。这种波动在用于STORM成像的闪烁染料以及量子点中广泛存在。因此，典型的荧光团包括量子点和任何用于STORM采集的闪烁染料，如Alexa 647。

对于单次SOFI采集，会捕获数百到数千帧图像。与STORM不同，荧光团的信号可以重叠而不会降低分辨率，但SOFI图像中不会保留任何非波动信号。此外，SOFI的荧光团闪烁可以在任何时间尺度上发生，只要暗态寿命与帧率处于同一数量级即可(Geissbuehler, Dellagiacoma and Lasser, 2011)。

成像系统应针对最大衍射极限分辨率进行优化，与其他超分辨率技术类似，像素尺寸的要求仅需点扩散函数(PSF)跨越超过一个像素，正如奈奎斯特采样率的情况一样。尽管必须避免样本的漂移和移动，但由于SOFI采集所需的时间较短且帧数相对较少，这使得它非常适合活细胞成像，如图1和图2所示.

图2：展示了宽场(上)与SOFI(下)对比时的分辨率提升。图像显示了COS-7细胞，其微管网络用Alexa 647偶联抗体标记。上)原始荧光图像，200帧平均。下)通过分析相同200帧获得的SOFI图像。箭头指向仅在SOFI图像中可分辨的特征，表明分辨率得到了增强。比例尺5 μm，来自Dertinger等人(2012)。

SOFI图像分析

从根本上说，SOFI分析的过程是输入静态样本的图像序列，并输出一张图像，其中每个像素显示相关程度(要么是该像素随时间的变化，要么是与其最近邻像素随时间的变化)。为了快速简便地进行SOFI分析，已经开发出一种名为Localizer的开源计算工具(Dedecker等, 2012).

SOFI最简单的形式是二阶自相关SOFI或AC-SOFI，如图3所示。如图3B，在电影采集过程中，多个帧捕捉到的荧光团发出的光太近，由于它们的点扩散函数(PSFs)发生重叠，无法通过常规方法分辨。然而，这些荧光团发出的光在时间上是相关的。如果一定数量的光子击中一个像素，且这些光子源自同一个荧光团，该像素的时间自相关性就会更高。该像素在SOFI图像中将具有较高的值。而接收到来自许多不同光源(包括焦外光)光子的像素，其相关性较低，因此值也较低。

图3：AC-SOFI原理。(A) 焦平面上的荧光团分布。每个荧光团随机发出荧光，且与其他荧光团互不相关。(B) A图中虚线方框的放大细节。发射体荧光分布的信号与系统的PSF卷积，并由相机捕获。由于衍射极限，两个相邻的发射体无法被分辨。这些波动被记录在一段视频中。(C) 继B图之后，每个像素包含一条时间轨迹，该轨迹由所有点扩散函数(PSF)延伸至该像素的单个发射体信号之和组成。(D) 二阶相关函数根据每个像素的波动计算得出。(E) 为每个像素分配的SOFI强度值由二阶相关函数的积分给出。二阶相关函数与PSF的平方成正比，从而将成像系统的分辨率提高√2倍。图片来自Dertinger等人(2009)。

SOFI理论将荧光图像视为单个荧光团的集合，在我们的成像应用中，这些荧光团随时间波动(例如从“开启”状态变为“关闭”状态)但并不移动。从数学角度来看，SOFI通过在相关函数中将荧光与其自身相乘来获得分辨率优势。对于2nd在SOFI中，相关函数随PSF的平方而非PSF缩放，这意味着PSF在每个维度上实际上缩小了√2倍。

高阶SOFI分析

方便的是，SOFI的分辨率可以通过更高阶的相关计算来离散地提高。对于阶数为的SOFI，AC-SOFI可以将分辨率提高√倍。SOFI的基本形式是2阶SOFI，涉及两个时间点之间的相关性(自相关SOFI或AC-SOFInd) 或空间中的两个点(互相关 SOFI 或XC-SOFI) 针对同一像素。事实上，可以同时检查多达次测量值的相关性，这只是对标准两次测量概念的简单外推，如图4所示n measurements at the same time, which simply extrapolates the idea for the standard two measurements, as seen in Fig.4.

高阶会为相关函数引入更多点——然而，高阶相关性的计算包含低阶项，这会降低分辨率。为了克服这一问题，使用高阶累积量代替相关性，从而忽略这些低阶项。这些累积量的数学形式在(Dertinger, Colyer, Iyer, Weiss, & Enderlein, 2009)的补充信息中有所描述。

本质上，高阶SOFI会提高分辨率，但它们也会增大样本初始明亮区域与暗淡区域之间、以及高波动源与弱波动源之间的差异，因此SOFI的阶数选择是在分辨率与可用图像动态范围(以及计算时间)之间进行权衡。

图4：沉积在盖玻片上的量子点(QDs)的渐进高阶AC-SOFI图像。从左上到右下：原始视频帧、第2、4、9、16和25阶AC-SOFI，显示分辨率逐渐提高，直到量子点被清晰分辨。量子点的相对强度将取决于每个量子点的特定闪烁特性。比例尺250纳米。图像来自Dertinger等人(2009年)。

互相关SOFI

AC-SOFI 仅通过单个像素的时间自相关来提高对比度和分辨率，同时保持原始图像中的像素数量。该技术的扩展版本称为交叉相关 SOFI(XC-SOFI)，可通过相邻像素之间的交叉相关在原始图像的像素之间生成亚像素，这在图5中得到了验证。这增加了采集所能包含的信息量，并意味着 SOFI 对探测器像素尺寸的依赖程度降低(Dertinger等, 2010).

XC-SOFI 与一种名为傅里叶重加权的技术几乎同时被引入，该技术与反卷积有相似之处。利用该技术，PSF 对图像的影响可以进一步降低，这意味着阶 XC-SOFI 的分辨率提升从 √提高到. 因为还有个-倍的子像素(水平和垂直方向)增加，傅里叶重加权XC-SOFI实现了真正的分辨率提升(Dertinger等 . As there is also an n-fold increase in sub-pixels (both horizontally and vertically), Fourier Re-weighted XC-SOFI is delivering a true resolution increase (Dertinger et al., 2010).

图5：XC-SOFI中通过最近邻像素的交叉累积量生成子像素的示意图。红色像素代表虚拟像素，蓝色像素是“真实”的相机像素。A)二阶XC-SOFI通过像素对(用箭头标记)的时间相关性将像素数量增加到四倍。B)4阶XC-SOFI不仅利用最近邻像素，还利用更远像素的时间相关性，将像素乘积扩展至16个。图片来自Dertinger等人(2010)。

SOFI面临的挑战

漂移

SOFI成像面临的一个主要挑战，与基于定位的技术类似，是样品中的运动(如漂移)。如果未在SOFI分析前进行校正，这将导致SOFI图像模糊，甚至可能导致图像中出现负值。

动态范围

高阶SOFI分析增加了图像中最亮和最暗区域之间，以及高相关性和低相关性区域之间的动态范围。这可能导致样本中灰度级出现极大差异，意味着使用相同的直方图显示比例设置时，不同区域和结构可能难以观察。将灰度级非线性映射到显示亮度或颜色查找表可以改善这些显示问题。

相关噪声

SOFI依赖于图像中唯一的关联源是单个荧光分子的相关光。然而，其他相关信号源也可能被包含进来，例如来自室内灯光的50Hz闪烁、实验装置的共振或相机中的相关噪声。

通常情况下，成像中与相机相关的噪声在定义上是互不相关的。但某些相机技术会产生相关噪声，表现为图像在空间或时间上的结构化波动。尽管影响较小，这些相关性可能会人为地增加图像中观察到的相关程度。

3D和多光谱SOFI

与STORM和其他超分辨率方法类似，SOFI也可以应用于3D成像。这可以通过使用电动显微镜载物台进行轴向扫描来实现。同时进行3D SOFI也是可能的;目前已有多种方法被提出并实现，例如多平面SOFI，其中使用多平面棱镜可同时高速成像多达8个平面(Descloux等, 2018).

或者，也可以利用类似于3D STORM的技术，将荧光分子的额外信息编码到其PSF中，其中引入的散光或螺旋性取决于分子的轴向位置。最近，一种利用SOFI获取PSF/波形工程信息的一般方法被提出(Purohit等, 2019)，并对在单个轴向平面成像的量子点轴向位置进行了概念验证测量。作者提出，光谱信息可以类似地编码到点扩散函数(PSF)中，从而实现单图像多通道采集。

多通道SOFI的另一种方法利用了SOFI的超分辨率机制，不仅在空间维度上，还在光谱维度上(Grussmayer等，2019)。从两个光谱分离的波长通道开始，引入第三种荧光团，故意在两个通道之间产生串扰。利用波长通道之间的相关信息，可以高精度地分离三个通道中的分子，如图6所示。图6.

图6：HeLa细胞细胞骨架、细胞核和细胞膜的多色SOFI图像。a) 反射(绿色)和透射(红色)通道获取的平均强度叠加图。b) 二阶光谱互累积图像的RGB合成图，包含2,(绿色)、2,(蓝色)和2,(红色)。c) 解混、展平及反卷积后的SOFI图像RGB合成图，包含d) Alexa Fluor 647染色的核膜(红色，χ2{3})、e) 小麦胚芽凝集素-Atto565标记(绿色，χ2{2})和f) Alexa Fluor 488染色的微管(蓝色，χ2{1})。单独的解混图像使用伪彩色显示。比例尺5 μm。图像来自Grussmayer等人，(2019)。

SOFI相机

SOFI是一种高速超分辨率技术，因此最适合与具有小像素或在特定放大倍数下针对奈奎斯特采样优化的像素的高速相机配合使用。通常，像素最小且速度最快的相机是sCMOS相机，它们能以每秒数百帧的速度运行，并通过扳机与光源同步，从而进一步提高SOFI的实验效率。根据最终分辨率的不同，相机像素尺寸也可以与奈奎斯特采样匹配，以确保探测器在SOFI样本上不会出现欠采样。

摘要

SOFI 为荧光分子波动的样本提供了一种多功能、高速且低成本的计算超分辨率成像技术。通过选择所使用的 SOFI 分析阶数，可以调节分辨率提升的程度。更先进的技术，如傅里叶重加权互相关 SOFI，能够进一步获得额外的图像像素信息，并相应地减小点扩散函数(PSF)的尺寸。与 SIM 等技术相比，SOFI 对装备的要求较低;与 STORM 相比，它对样本和信噪比(SNR)的要求也较低，因此 SOFI 是超分辨率成像领域的一种宝贵工具。