生物偶联寡核苷酸类药物非临床安全性评价考量点

传统生物制品与小分子药物以蛋白质为作用靶点，与之不同，寡核苷酸能够调控信使RNA、非编码RNA及RNA结合蛋白的功能，进而调节致病蛋白的活性。通过靶向作用于转录组，寡核苷酸可纠正异常基因表达、沉默致病基因，或增强人体内有益基因的表达。寡核苷酸药物主要包括小干扰RNA（siRNAs）、反义寡核苷酸（ASOs）、RNA编辑药物及适配体。

将寡核苷酸与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联，可显著提升药物靶向递送能力。GalNAc能够结合肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体，促进肝细胞对药物的摄取，大幅提升该类药物在肝脏相关疾病治疗中的疗效。除GalNAc偶联技术外，将寡核苷酸与转运型抗体、多肽、脂质纳米粒等载体结合，可以实现肝脏以外组织的靶向递送，即生物偶联寡核苷酸（bioconjugated oligonucleotides, BCOs）。生物偶联寡核苷酸兼具生物大分子/多肽的靶向特异性与寡核苷酸的作用精准性，能够选择性抑制疾病相关靶点。将siRNAs或ASOs通过小分子连接臂与抗体偶联，是目前发展最为成熟的技术路径。

抗体偶联寡核苷酸被细胞内吞后，其中的寡核苷酸片段会结合靶标信使RNA，进而产生药效反应。siRNAs可借助RNA诱导沉默复合体通路促使靶标信使RNA降解，降低致病蛋白的表达水平；而ASOs可调控RNA剪切过程、阻断mRNA翻译，在多个调控层面影响基因表达。下图汇总了抗体偶联寡核苷酸成功研发所需具备的特性与评价标准。

BCOs由蛋白/多肽支架、化学连接臂、寡核苷酸药效片段三大模块构成，各模块独立或共同决定了整体药物的安全风险。这点与ADC有点像，只不过将payload换成了寡核苷酸。BCOs的每一组分（生物大分子/多肽支架、化学连接子、寡核苷酸片段）均会带来独特的安全隐患，还可能引发结构稳定性异常、非预期裂解、脱靶结合、新型化学结构相关遗传毒性、药物在组织/细胞内蓄积、免疫原性及血液系统损伤等问题。

下表总结了大分子、小分子/寡核苷酸、BCOs三类产品的非临床毒理策略的异同点。

BCOs重复给药毒理试验的剂量选择与监管要求

BCOs由生物大分子（多肽/抗体）、化学连接臂、寡核苷酸三大组分构成，类似ADC产品，作用机制具备多模式特征，因此其非临床安全性评价需同时遵循《人用药品注册技术要求国际协调会S6(R1)指导原则》与《人用药品注册技术要求国际协调会M3(R2)指导原则》（见上表）。直白讲，既要参照大分子，也要兼顾小分子的要求。

剂量设置方面，ICH M3和ICH S6都有对应要求，剂量选择依据包括：最大可行剂量、最大耐受剂量、最大预期药理效应剂量；或结合体表面积换算，设置相较于拟定临床最大剂量10倍至50倍的安全范围。为什么是10和50这两个数字呢，如前所述，要兼顾大小分子的要求。

全球不同监管机构、同一机构不同部门的评审标准存在差异，会影响非临床毒理试验方案的获批，以及非临床申报资料的整体认可度。例如，不同监管部门对于是否需要开展人hERG试验、是否需针对未偶联药效片段、连接臂、连接臂-寡核苷酸复合物开展啮齿类动物试验，要求各不相同；部分地区监管机构还会要求在两种动物种属中开展长期毒性试验。个人理解，这里可以参照ADC的思路处置，比如如果是新寡核苷酸（对标新payload），可以采用寡核苷酸开展单独的啮齿类动物一般毒理研究，考察在靶和/或脱靶毒性。

此外，给药途径（鞘内注射、静脉注射、皮下注射）、适应症类型（肿瘤、眼科、心血管、神经、疼痛、肾脏相关疾病）也会影响非临床试验的设置。因此，在启动关键的首次人体试验配套毒性试验前，建议与全球各监管机构提前沟通，达成共识。

BCOs重复给药毒性试验的相关动物种属选择

BCOs通常需在两种动物种属（啮齿类动物、非啮齿类动物）中开展毒性试验。种属选择的合理性需结合多项证据，既要考虑抗体端，也要兼顾寡核苷酸的药理学相关性，包括：靶标基因序列同源性、靶标蛋白表达水平、受试药物与动物靶标的结合亲和力、药物杂交特性与人体的相似度、受试药物在动物体内的药理活性与人体的一致性等。

若申请仅采用单一种属开展试验，需提供充分数据证明：对于完整临床候选药物而言，其他种属的受体结合特性、药理活性与毒性评价无关联。

对于BCOs，非人灵长类动物通常是药理相关性最高的种属，熟悉抗体类药物、寡核苷酸类药物毒理研究的应该很容易理解这点，这两类产品非临床研究药理学相关动物种属基本都是以非人灵长类为主。抗体+寡核苷酸二合一以后，自然还是如此。理论上，非人灵长类动物体内，抗体组分的靶点结合亲和力、寡核苷酸组分与信使RNA的杂交特性均与人体接近。在非人灵长类动物试验设计中，在条件允许的前提下，可适当减少每组动物数量（如每组每性别3只，常规为每组每性别4只），并酌情删减恢复期动物组。当然，如果国内申报或者多国申报，监管要求就高不就低，还是建议每组每性别5只。

即便抗体、寡核苷酸组分在啮齿类动物体内无明显药理活性，按照ICH M3及美国FDA《寡核苷酸类治疗药物非临床安全性评价（草案指导原则）》要求，目前仍需在啮齿类动物体内开展重复给药毒性试验，主要用于评价连接臂-寡核苷酸引发的、与杂交作用无关的脱靶毒性。关于这点，可以翻看笔者之前分享的寡核苷酸类药物非临床安全性评价策略的主题文章。

BCOs重复给药毒性试验的设计要点

设计BCOs重复给药毒性试验时，需增设专项评价指标，全面表征不同药物类别对应的典型毒性反应。

生物大分子药物进入试验动物体内后，易诱发免疫相关毒性：动物机体可识别异源人源抗体，产生抗药抗体。抗药抗体可能对试验无明显影响，也可能中和药物药理活性、降低药物暴露量，甚至引发轻至重度毒性反应。当然，动物体内由抗药抗体介导的超敏反应，无法直接外推至人体，也不能用于预测人源化蛋白药物在人体内的免疫原性。

人源蛋白在动物体内引发超敏反应是常见风险，典型临床表现出现在给药后1小时内。若需确认毒性反应由抗药抗体介导，需在常规毒性试验中增设相关检测：给药前、给药后分别检测抗药抗体水平，评价补体激活、C反应蛋白指标，观察组织内免疫复合物形成情况。抗药抗体通常在多次给药后数周逐步产生，因此样本采集时间点的设置至关重要。

以上讨论的主要是抗体端引入的免疫原性、免疫毒性风险的评估。那么寡核苷酸组分又有哪些额外关注点呢？

反义寡核苷酸的典型毒性反应包括血小板减少、药物在肝肾组织蓄积、组织滞留时间长、免疫原性。常规重复给药毒性试验虽已包含血小板、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间检测，但仍需补充评价指标：组织内反义寡核苷酸浓度、肾损伤生物标志物、细胞因子、补体激活水平。

寡核苷酸（含反义寡核苷酸）在组织内滞留时间较长，该特性会直接影响试验给药频次与恢复期时长。

药物在组织内蓄积，会增加不同剂量下毒性结果的外推难度。因此重复给药毒性试验中需设置合理的恢复期（无需所有试验均设置），一方面判断急性毒性反应的可逆性，另一方面监测因药物组织蓄积引发的迟发性毒性。

反义寡核苷酸可直接激活补体系统，该反应呈剂量依赖性，首次给药后即可观察到；而生物大分子药物的补体激活，多为抗药抗体引发的继发性反应。

除了抗体组分、寡核苷酸组分，别忘了，这里面还有连接臂。我们知道，小分子药物首次人体试验的全套安全性评价内容，包含脱靶药理作用、安全药理学、遗传毒性、两种种属重复给药毒性试验。因此，研究人员需评估化学连接臂是否需要纳入上述专项试验，比如设置单独1或2组考察连接臂毒性。评估依据包括：同类结构连接臂的已有安全数据、连接臂是否为全新化学结构、连接臂在胞外环境中是否可裂解。结合以上信息，可采用证据权重法论证豁免连接臂专项试验的合理性，最终方案需与全球监管机构达成一致。

最后说下伴随的TK检测，既要检测完整BCOs，也要检测释放的连接臂和/或寡核苷酸，还要关注下寡核苷酸的代谢产物。

BCOs的安全药理学评价要点

若选用非人灵长类动物作为非啮齿类试验种属，可将心血管、呼吸系统、中枢神经系统三大核心安全药理学评价指标整合至符合GLP的重复给药毒性试验中，无需单独开展试验。

目前针对BCOs的专项监管指导原则仍在制定中，该类药物的非临床安全性评价，可借鉴成熟的寡核苷酸药物与生物偶联药物（如ADC）评价体系。

将安全药理学评价整合至非人灵长类动物重复给药毒性试验，对BCOs研发具备多重优势：寡核苷酸类药物的药代动力学存在明显滞后效应——血浆药物浓度衰减较快，但药物在组织内滞留时间长、药理作用持久。整合式试验设计可减少试验动物使用，符合动物伦理要求，同时兼顾药物短期血浆暴露引发的即时效应，以及长期组织滞留引发的迟发性功能异常。

由于BCOs在组织内清除缓慢、靶标调控作用持久，在给药全程及停药恢复期开展多次功能学检测，可及时发现器官功能的累积性改变与适应性变化。

在同一组非人灵长类动物样本中同步获取安全药理学、毒代动力学、病理学、临床化学数据，可实现不同评价终点的交叉比对，明确功能异常的作用机制，同时为临床试验的监测方案提供依据。

根据ICH S7B，体外人hERG试验是评价药物引发心室复极延迟风险的重要环节。ICH S6(R1)指出，体外hERG试验不适用于生物大分子药物，且该类药物分子量大，无法穿透细胞膜抑制离子通道，试验结果参考价值极低。

但寡核苷酸具备小分子药物的部分特征，因此即便试验方法未完全经过方法学验证，行业仍会针对寡核苷酸开展体外hERG试验。若某类寡核苷酸化学结构、序列经充分验证，证实对人hERG通道活性与表达无影响，则可豁免该项试验。

若BCOs靶向分布于非心脏组织，也可据此论证豁免人hERG试验。反之，若预判药物可通过生物大分子结合作用、药效片段的直接/间接/下游通路影响人hERG相关基因，则需开展体外人hERG相关基因试验与体内心电图检测（分析QT、QTc间期）。

BCOs的组织交叉反应与溶血试验评价要点

BCOs里面有抗体组分，含有CDR功能区，自然要开展组织交叉反应试验，也就是TCR研究。开展TCR试验，可明确完整偶联药物在人体组织中的结合部位，区分预期靶向位点与非预期结合位点，提前识别潜在毒性风险。

需要注意的是，TCR试验需采用完整生物偶联寡核苷酸，而非单独的抗体组分。现有数据无法证实：偶联寡核苷酸后，抗体的组织分布与结合特性不会发生改变。

寡核苷酸具备独特的化学特征（分子尺寸、负电荷、亲水性），可能与细胞表面发生非特异性相互作用，改变蛋白支架的组织识别与结合能力，进而影响靶向特异性与安全性。此外，连接臂化学结构、药物-抗体比例，也会对组织交叉反应结果产生影响。

在部分特殊情况下，若已有体外结合数据证实连接臂-寡核苷酸不会造成空间位阻，也可单独评价生物大分子组分。

经静脉给药的BCOs，通常需开展溶血试验。该试验用于评价药物制剂是否会破坏红细胞膜，早期预警制剂相关细胞毒性与局部耐受性风险。溶血试验可高效筛选辅料（表面活性剂、盐类、渗透压调节剂）、药液pH值、离子强度，判断上述因素是否会在注射部位或意外血管内暴露时增加溶血风险。

BCOs的生殖发育毒性评价要点

根据ICH S5(R3)、ICH M3(R2)，若临床试验纳入育龄人群、临床试验周期超过3个月，或育龄受试者人数超过150人，需提前完成非临床生殖发育毒性试验。周期较短、育龄受试者人数较少且受试者采取避孕措施的临床试验，可酌情延后开展。

发育毒性试验的动物种属选择，主要依据受试动物种属与人体靶标同源蛋白的序列相似度、药物药理活性一致性。

多数BCOs仅在非人灵长类动物与人体内具备药理活性，在啮齿类动物、家兔体内无作用。非人灵长类动物的强化围产期发育试验样本量不足，无法有效评价生育力指标，且试验操作复杂、成本高昂，同时违背动物实验3R原则，也不符合美国FDA近年来倡导的减少非人灵长类动物使用的政策。

因此，研发人员可构建啮齿类动物反应型替代分子或转基因啮齿类动物模型，规避非人灵长类动物生殖发育毒性试验；但需充分验证替代分子在啮齿类动物体内的药理作用，确认其与临床候选药物在人体内的药理效应无明显偏差。

可采用“临床候选药物+啮齿类动物反应型替代分子”组合，在啮齿类动物体内开展生殖发育毒性试验。啮齿类动物反应型替代分子需完整复刻临床候选药物结构（啮齿类动物反应型蛋白支架+连接臂-寡核苷酸），并完成全面表征，保证其与临床候选药物具有可比性，评价指标包括受体结合能力、结合亲和力、血浆药代动力学、靶组织药理反应。

若替代分子仅部分组分（蛋白支架或连接臂-寡核苷酸）可在啮齿类动物体内发挥作用，则无法完整表征偶联药物整体的生殖毒性。同时，需评估替代分子是否会产生与临床候选药物无关的混杂毒性，以及该类结果对人体风险外推的影响。针对生殖发育毒性评价方案，建议提前与全球监管机构沟通确认。

BCOs的遗传毒性评价要点

按照ICH M3(R2)与ICH S2(R1)的要求，首次人体临床试验前需完成遗传毒性评价。

若BCOs的蛋白支架、化学连接臂、寡核苷酸药效片段含有非天然人工合成结构或修饰残基（统称“新型化学结构”），则需针对完整药物或各独立组分开展遗传毒性风险评估。反之，若药物仅使用天然氨基酸、天然核苷酸，通常无遗传毒性风险，无需开展专项遗传毒性试验。

对于需要评价遗传毒性的候选药物，试验方案需遵循ICH S2(R1)，重点针对含新型化学结构的组分开展评价。标准遗传毒性试验组合包括：细菌回复突变试验（Ames试验）、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体外微核试验/染色体畸变试验；体内微核试验/染色体畸变试验可整合至啮齿类动物重复给药毒性试验中开展。

对于结构已知、安全性数据充分的非天然核苷酸或化学连接臂，可复用已有安全数据，不需额外开展，前提是寡核苷酸序列与靶标不会改变原有毒性特征。

生物大分子药物暂无标准化遗传毒性试验方法，且完整生物偶联药物难以进入细菌试验体系。因此，建议单独评价含新型化学结构的化学连接臂、寡核苷酸、连接臂-寡核苷酸复合物，而非完整生物偶联药物。

化学连接臂为实现偶联功能，本身具备一定反应活性。若需针对连接臂开展遗传毒性试验，可对连接臂活性位点进行封闭处理，在保留生物偶联药物整体化学特征的前提下，避免连接臂发生非特异性反应。这点容易理解，只需考察遗传毒性，减少其它因素的干扰。另外，条件允许时，可将体内遗传毒性评价指标整合至符合GLP的啮齿类动物重复给药毒性试验中。

BCOs的致癌性评价要点

针对非肿瘤适应症、需长期甚至终身用药的BCOs，在药品上市前还需完成致癌性评价。目前生物偶联寡核苷酸的致癌性评价体系仍在完善中，主要参照ICH M3(R2)、ICH S6(R1)、ICH S1B(R1)。

正式致癌性试验前，需在大鼠、小鼠体内分别开展最长6个月、最长1个月的剂量探索试验，为大鼠两年终身致癌性试验、Tg.rasH2转基因小鼠6个月致癌性试验确定给药剂量。

人源化生物偶联药物在啮齿类动物体内长期重复给药时，易诱发免疫反应、过敏样反应或产生中和抗体，导致药物暴露量下降，因此直接采用临床候选药物在啮齿类动物体内开展长期试验可行性较低。建议提前评价抗药抗体介导的免疫原性风险，也可构建鼠源化替代分子用于致癌性试验。但啮齿类动物同源替代分子的试验结果，能否直接外推至人体，存在较大不确定性，试验参考价值有限。

目前，BCOs的致癌性评价尚无统一标准方案，需结合多项ICH指导原则综合判断。因此，在项目早期与全球监管机构沟通、确定致癌性评价方案至关重要。行业目前主流评价思路分为三类：

1. 参照美国FDA《寡核苷酸类治疗药物非临床安全性评价（草案指导原则）》，采用证据权重法论证：若该类寡核苷酸已有充分致癌性安全数据，可仅在单一种属内开展两年终身致癌性试验；

2. 参照ICH S1B(R1)，采用证据权重法证实药物人体致癌风险极低、两年终身试验无额外参考价值，以Tg.rasH2转基因小鼠6个月试验替代两年终身试验；

3. 参照ICH S6(R1)，采用证据权重法论证无需开展额外致癌性评价。

具体方案需结合药物组分、结构特征、作用通路、已有安全数据逐一判定。

监管相关

目前尚无针对寡核苷酸偶联药物的专项监管指导原则，抗体偶联寡核苷酸、氨基酸序列超过40个的多肽偶联寡核苷酸，主要参照ICH M3(R2)、ICH S6(R1)、ICH S9及FDA相关法规。

在具备充分科学依据的前提下，可向监管机构申请采用非传统非临床试验方案，具体参考下表。

讨论与结论

生物偶联寡核苷酸的非临床研发，必须采用整合式评价思路，充分考虑复合药物独特的药代动力学、药效动力学与安全特征。

针对抗体/抗原结合片段偶联寡核苷酸，非临床风险评价不能仅关注寡核苷酸药效片段。药物三大组分（抗体支架、化学连接臂、寡核苷酸）均存在独立安全风险，且不同组分的风险会相互影响：抗体相关风险包括免疫原性、Fc介导的效应功能、靶点相关毒性；连接臂-寡核苷酸相关风险包括血小板减少、补体激活、组织蓄积、脱靶杂交。

部分偶联药物可同时结合两个靶点（如穿越血脑屏障的转铁蛋白受体抗体偶联寡核苷酸），双重靶向特征进一步增加了安全评价的复杂度，单一组分的评价结果无法反映整体药物的风险。

相关动物种属选择是BCOs非临床研发中最关键、难度最大的环节。非人灵长类动物因靶标同源性、组织分布与人体高度一致，通常是药理相关性最高的试验物种；但按照监管要求，仍需开展啮齿类动物试验，用于评价连接臂-寡核苷酸引发的脱靶毒性、化学结构相关毒性。

若啮齿类动物与药物靶标无药理相关性，其试验结果对于预判人体药理介导风险的参考价值有限。对此，研发人员可在具备科学依据的前提下申请优化方案：缩短啮齿类动物试验周期，仅评价非杂交相关毒性；仅在药理相关的非啮齿类动物体内开展长期毒性试验；采用啮齿类动物反应型替代分子开展试验。上述方案均需提前与监管机构达成一致。

目前，构建啮齿类动物反应型替代分子、转基因动物模型已成为主流折中方案，在遵循动物实验3R原则、不影响人体安全评价的前提下，完成生殖发育毒性、长期毒性评价。

寡核苷酸组织滞留时间长、药理作用持久，因此更适合将安全药理学、遗传毒性等功能学评价指标整合至重复给药毒性试验，而非沿用小分子药物的独立试验模式。

遗传毒性、致癌性试验需区分全新化学结构与成熟组分，成熟组分可充分复用历史安全数据。在具备充分机制研究、平台数据支撑的前提下，采用证据权重法可精简试验内容、减少试验动物使用，同时保障受试者安全。

需严格保证转运载体、连接臂、寡核苷酸骨架的一致性，微小的结构调整都可能引发非预期效应，且试验结果不一定能外推至人体。

引自: Hitching a Ride to Overcome Barriers: Nonclinical Safety Considerations for Bioconjugated Oligonucleotides

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