临床前模型导致肿瘤药物开发失败的原因及潜在改进策略

美国FDA数据显示，动物实验中显示安全有效的药物，绝大多数因在临床安全性/疗效不佳未获批准。临床前测试向早期临床试验转化的高失败率，主要源于模型系统（体外/体内）的缺陷和实验策略的不当。本文分析下失败率居高不下的可能原因及潜在解决方案。

细胞培养模型的问题

（一）二维与三维模型的差异

新型候选药物的初步评估多始于细胞培养模型，合理选择与药物作用机制匹配的肿瘤模型是实验的关键前提。

1.二维（2D）模型

以实体瘤单层培养、血液肿瘤悬浮培养为代表，因操作简便、成本低成为药物研究中生成初步数据的主流模型。但2D细胞培养存在显著缺陷：肿瘤细胞处于营养丰富、高氧环境，呈指数生长，无免疫系统参与，且常被同时暴露于高浓度单药/联合药物中，缺乏药代动力学和代谢过程，与体内真实肿瘤微环境差异极大。

2.三维（3D）模型

主要包括肿瘤球状体和类器官，能更好模拟肿瘤组织的生理特征，是2D模型的重要补充，但存在操作复杂、成本高的问题。肿瘤球状体在全液体培养基中生长，分为单纯型（仅肿瘤细胞）和复合型（肿瘤细胞+内皮细胞、成纤维细胞等基质细胞），可形成细胞间黏附作用和缺氧核心，更接近体内肿瘤组织。比如，NCI60细胞系可在超低吸附板中培养为3D球状体。肿瘤类器官在基质胶中培养，需添加生长因子、细胞因子和小分子激酶抑制剂，以维持干细胞样表型、抑制上皮-间质转化（EMT）。但类器官的构建难度大、维护成本高，导致研究中常退而选择2D模型。

（二）细胞系的选择缺陷

部分被广泛使用的肿瘤细胞系，与临床对应癌症的治疗特征存在显著偏差，导致研究结果的临床转化价值降低，以前列腺癌为例：

临床中去势抵抗性前列腺癌的一线治疗为雄激素阻断疗法，但研究中最常用的PC-3、DU-145细胞系缺乏雄激素受体（AR），对恩扎卢胺等雄激素阻断药物不敏感，与临床疾病特征不符。

更具临床相关性的模型（如表达AR的22Rv1细胞系、LuCaP35CR PDX模型、基因工程小鼠模型GEMM）却极少被使用。此外，将雄激素依赖性LNCaP细胞系改造为去势抵抗性亚型（C4-2、C4-2B），或利用TRAMP、LADY等GEMM模拟人类前列腺癌进展，均为更合理的选择。

需要注意的是，PC-3、DU-145细胞系并非无转化价值——两者均为p53缺陷型，而p53异常是前列腺癌不良预后的标志物，在50%以上的晚期/转移性前列腺癌中驱动疾病进展和耐药，因此在这些细胞系中表现出活性的药物，可能对临床中未被满足需求最高的p53缺陷型前列腺癌亚群有效。

（三）药物浓度的使用不当

临床前体外/体内研究中，抗癌药物的浓度/剂量选择不当是普遍问题。研究者极少为细胞培养中的药物浓度提供合理依据。即使药物获批后临床相关浓度已明确，仍有研究使用不当的模型系统和实验设计，阻碍药物向新适应症/联合方案的拓展。这直接造成药物药代动力学与敏感性/应答之间的显著脱节，典型案例如下（下表为主要药物的临床前与临床浓度对比）：

典型药物案例

1. 替莫唑胺：胶质母细胞瘤（GBM）的标准治疗药物，为前药，在多数细胞中体外活性差；体内活性形式通过DNA碱基甲基化发挥作用，O6-甲基鸟嘌呤是其最具毒性的修饰产物。患者中枢神经系统中的替莫唑胺浓度，远低于多数实验GBM模型中抑制肿瘤生长所需的浓度。仅31%的MGMT低表达/错配修复（MMR）正常的细胞系，在临床相关浓度下对替莫唑胺敏感。

2. 曲美替尼：MEK1/2抑制剂，临床血药峰浓度（Cmax）为21nM，但大量研究仍使用高达1000nM的浓度进行测试。

3. 他拉唑帕利：PARP抑制剂，临床Cmax为43nM，却常被用于200nM及以上的细胞培养研究。

4. 硼替佐米：蛋白酶体抑制剂，临床Cmax为312nM，此前研究中曾使用高达50μM的体外浓度，近年仍有研究使用1-10μM的超临床浓度。

5. 奥希替尼、吉非替尼、达沙替尼、克唑替尼：均为激酶抑制剂，临床前研究中使用的浓度普遍为临床相关浓度的数倍至数百倍。

（四）培养形式对药物敏感性的影响

即使选择了临床相关药物浓度，培养条件和药物暴露时间仍会显著影响药物应答——肿瘤对多种药物的敏感性依赖于生长模式。

以NSCLC细胞系为例，在临床Cmax浓度的EGFR抑制剂（厄洛替尼、阿法替尼、拉帕替尼、奥希替尼）作用下，EGFR L858R突变的LG0703-F948患者来源细胞系，球状体培养时对四种抑制剂均敏感，单层培养时均耐药；EGFR E746-A750缺失的HCC827细胞系，球状体和单层培养时均敏感；EGFR T790M/L858R双突变的NCI-H1975细胞系，球状体培养时对奥希替尼敏感，单层培养时耐药。

这表明细胞表面靶点的表达和药物敏感性随培养形式变化，也是细胞培养与体内实验结果存在一致性/差异性的重要原因。

荷瘤动物研究的问题

（一）PDX的缺陷

与传统的CDX相比，PDX模型直接源于癌症患者，是更接近临床的模型。PDX模型推动了基于肿瘤基因组特征的个体化药物选择，但存在显著局限性：1）成瘤率低、生长缓慢、可重复性差；2）为获得稳定的生长速率而在小鼠中多次传代后，肿瘤会丢失原代肿瘤的部分特征；3）药物开发的时间周期长，针对特定PDX模型筛选的最优治疗方案，临床应用时往往仅能作为二线/三线治疗。

（二）免疫系统在药物作用中的缺失

多数癌症治疗依赖于肿瘤、肿瘤微环境（TME）和ADME的多方面相互作用，而新型肿瘤治疗手段（如免疫检查点抑制剂、免疫激动剂、T细胞衔接器、癌症疫苗）的活性高度依赖人类免疫系统；部分抗体药物偶联物（ADC）的活性也受免疫系统影响（如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性ADCC）。

大部分CDX和PDX模型在免疫缺陷小鼠中开展，完全排除了免疫系统对治疗应答的贡献，而免疫系统是许多癌症药物临床活性的重要决定因素。为弥补免疫系统模拟的缺陷，同基因、嵌合、人源化小鼠模型的应用逐渐增加，这类模型表达相关人类表位且具有完整的免疫系统，各模型的特征如下：

1.嵌合小鼠模型

在免疫健全小鼠中工程化表达含人类表位的蛋白（如MC38-cEGFR、hCD3E-epi、MC38-hPD-L1），也就是通常所谓的靶点人源化动物，可在肿瘤-基质-免疫细胞相互作用的背景下评估新型人源癌症药物。且与全人源化小鼠相比，嵌合模型构建更简单、快速、成本低，通量更高。

缺陷：小鼠免疫系统与人工表达的人类表位存在不匹配，限制了人类免疫细胞特异性生物学的观察（如人类检查点/配体相互作用、抗原呈递、细胞因子信号），降低结果的转化价值。

2.全人源化小鼠模型

根据免疫重建的复杂度、广度、深度和治疗周期，分为不同亚型，各有优劣，适用于不同类型的免疫肿瘤学研究：

·人外周血单个核细胞（huPBMC）模型：2-4周内可重建人类T细胞，适合快速、短期评估T细胞连接器，但易发生异种移植物抗宿主病（xGvHD），干扰炎症评估，无法进行长期治疗。

·人造血干细胞（hu-CD34+）模型和骨髓-肝脏-胸腺（BLT）模型：构建耗时久、技术要求高，需特定供体材料和手术操作，但能实现更广泛、持久的适应性免疫重建，提升疫苗应答和免疫记忆的转化价值。其中BLT模型因使用胎儿胸腺和肝脏来源的CD34+细胞，存在伦理争议，但能实现人类MHC限制和更生理相关的T细胞受体（TCR）库，更适合T细胞中心的免疫肿瘤学评估。

3.细胞因子人源化小鼠模型

hu-CD34+和BLT模型均存在固有免疫细胞表达不足的问题，限制了Fc依赖的效应功能和髓系细胞相关疗法的评估。细胞因子人源化品系可提升NK细胞和髓系细胞的表达，但模型变异性更高，需对人类免疫重建水平和功能进行复杂分析，并验证药物靶点的种间交叉反应性。

模型优化与临床差异

嵌合和人源化模型虽各有取舍，但均显著提升了药物-肿瘤-免疫-基质相互作用的生理相关性评估。

但临床前模型仍无法解决临床研究的人群差异：首次人体（FIH）临床试验通常在复发/难治性（R/R）患者中开展，这类患者的肿瘤（如克隆进化、旁路通路、逃逸机制、靶点下调）和宿主免疫系统（如肿瘤浸润淋巴细胞、调节性T细胞/髓系来源抑制细胞紊乱）与一线治疗初治患者存在显著差异，导致即使在最优小鼠模型中表现出高活性的药物，在FIH研究中疗效也显著降低。也就是所谓的拿一线动物药效数据预测临床末线患者的效果。

（三）当前动物模型的其他核心局限性

1. 未考虑年龄因素：癌症多为老年疾病，老年与年轻小鼠对部分治疗的应答存在显著差异，但因饲养成本高、小鼠衰弱和药物耐受性问题，极少有研究使用老年小鼠。

2. 肿瘤接种部位非生理：皮下侧腹肿瘤接种操作简便，可准确评估肿瘤生长/应答，但极少有肿瘤的天然发生部位为侧腹。原位注射更具生理相关性，但技术难度大、需手术和伤口愈合、治疗应答监测更复杂，依赖无创成像或处死时的单点评估。

3. 免疫缺陷的固有问题：CDX模型几乎均在免疫缺陷小鼠中开展，排除了免疫系统的作用；PDX模型虽更具预测性，但同样在免疫缺陷小鼠中培养，存在相同局限。同基因肿瘤模型保留了小鼠的完整免疫系统，但啮齿类肿瘤和免疫体系与人类存在本质差异。人源化模型（NSG-SGM3、MISTRG、BLT）能结合人源肿瘤和人类相关免疫系统，但仅资金充足的实验室可开展。

4. 肿瘤体积与临床不符：为避免肿瘤体积超过伦理阈值，药物给药通常在肿瘤较小、未充分建立时启动，仅能模拟临床极早期疾病的治疗。而多数癌症患者接受治疗时已存在比较大的肿瘤负荷。

5. 给药途径缺乏临床相关性：新型治疗的研究常采用瘤内注射，而人类癌症治疗以全身给药（口服/静脉）为主；瘤内注射不仅临床相关性低，还可能破坏肿瘤结构，干扰结果解读。

6. 实验周期过短：动物研究的时间框架无法有效预测人类研究的效应：1）肿瘤生长延迟等终点指标过短，无法判断停药后肿瘤是否复发；肿瘤消退评估虽更优，但通常未结合动物生存改善这一临床相关终点；即使报告生存，也常因提前处死溶媒对照组而存在设计缺陷；2）传统异种移植和同基因肿瘤模型生长过快，除非药物疗效显著，否则无法进行多剂量治疗；评估药物的“治愈潜力”需监测小鼠整个生命周期（1.5-2.5年），远长于多数标准小鼠实验；3）短周期实验无法评估药物对肿瘤转移的影响，而转移是癌症相关死亡的最主要原因。

优化策略：①接种更少的肿瘤细胞，延缓肿瘤生长，延长治疗周期；②利用PDX模型生长缓慢的特点，开展多疗程药物治疗。

7.数据合并掩盖异质性：将多只小鼠的数据合并分析，会模糊药物应答的异质性；虽适用于评估平均肿瘤生长抑制（TGI），但无法识别对少数患者具有治愈潜力的药物（如免疫检查点抑制剂）。优化建议：采用单小鼠试验（SMT）设计，评估少数人群的药物效应。

8.啮齿类耐受性向临床的过度外推：小鼠对药物剂量和联合方案的耐受性远高于人类，导致动物模型无法准确预测临床治疗相关不良事件（AE），如心血管毒性、神经毒性、自身免疫病、胃肠道和皮肤反应等，典型案例：1）白介素-12（IL-12）：高剂量（45μg/kg）在小鼠中可有效减少B16黑色素瘤和Lewis肺癌的肺转移，且耐受性良好；但临床中相同剂量的重组人IL-12导致严重的胃肠道毒性、血细胞减少和全身症状，临床应答微弱，目前研究方向已转向肿瘤微环境的靶向递送；2）抗体药物偶联物（ADC）：若药物靶点仅在人类细胞中表达，啮齿类模型会高估ADC的治疗窗口——ADC的活性和毒性依赖于靶点的高表达和高效内化，人源特异性靶点使ADC在小鼠中表现出良好耐受性，但临床中毒性显著升高；且药物-抗体比率（DAR）越高，这种差异越明显（如抗CD30-vc MMAE ADC）。

此外，啮齿类和人类的AE差异还源于遗传背景、免疫通路、激素和代谢调节、微生物组的不同，部分AE仅在人类特异性辅因子存在时发生（如JC病毒相关的病毒再激活）。

细胞培养和荷瘤动物药物测试实验方法的改进

药物候选物的临床活性由多种因素决定，单一模型系统无法复现所有特征，但通过多模型联合分析各关键因素，可提升临床前结果的临床相关性。例如，对有潜力的药物可开展以下测试：免疫缺陷小鼠的CDX/PDX模型；含人类免疫细胞和肿瘤细胞的人源细胞共培养系统；同基因肿瘤模型（使用替代药物，靶点为小鼠肿瘤中天然存在的表位）。

开发更接近临床R/R疾病的模型，可进一步缩小临床前高预期与临床低疗效之间的差距。目前已有针对免疫检查点抑制剂耐药的模型被开发（如抗PD-1耐药的MC38模型、B16黑色素瘤疫苗耐药模型）。尽管无模型能完全复现药物-TME-免疫系统的复杂相互作用，但多模型联合可实现靶点的机制验证和免疫系统的参与评估，显著提升研究结果的整体转化价值。

NCI PMDR异种移植测试的关键发现：临床中有效的药物，在对应的临床前模型中也具有活性。这一发现可通过单小鼠试验（SMT）设计加以利用——即每个PDX模型和治疗组使用一只小鼠（若有足够多的同疾病异种移植肿瘤），该设计可模拟临床试验的异质性，更准确预测临床应答率，从而筛选出对异质性人类癌症患者具有显著临床影响的药物。

此外，FDA正推进新一代无动物临床前模型（NAMs）的开发，以减少/替代动物进行毒性和疗效测试，这类模型包括基于AI的毒性计算模型、正常细胞系和类器官毒性测试，核心类型及应用如下：

NAMs的优势与挑战

优势：1）利用人源系统，实现更准确的人类风险评估；2）高通量体外分析和计算机模型，提升化合物筛选的效率；3）深入阐明临床相关的作用机制和生物学通路，揭示化合物对人类正常组织的影响；4）减少动物实验的伦理争议。

挑战：NAMs的验证和可靠性评估仍在进行，其有效性、可靠性和适用性需与成熟的临床前模型充分比对后，才能广泛用于临床前安全性评估。

目前NAMs已产生具有转化价值的结果，支持多项FIH研究的启动（如基于类器官数据的BAL0891、SIGX1094研究）。

在NAMs完全成熟前，可通过合理的实验框架利用现有临床前工具，以下为肿瘤药物转化研究的理想实验设计步骤：

最后

癌症药物的临床前开发存在诸多缺陷，如超生理药物浓度的使用、模型选择不当、实验设计缺陷等。但近年来该领域已取得显著改进，包括更具临床相关性的动物模型、更严谨的实验策略，以及计算机建模、3D类器官等NAMs的开发，这类模型有望减少或完全替代动物模型。

随着这些模型的开发和应用，研究人员将能更准确地筛选出对未被满足需求较高的癌症患者具有显著临床价值的治疗策略。

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