Adv Sci | 杨吉龙/黄丹丹/李俊/王朝团队联合揭示黑色素瘤多重耐药的非编码调控新机制

近日，天津医科大学肿瘤医院杨吉龙教授、天津医科大学黄丹丹教授、天津医科大学/广州市妇女儿童医疗中心李俊教授及温州医科大学瓯江实验室王朝研究员鼎立合作，在国际期刊Advanced Science上在线发表题为Genome-Wide CRISPR Screen Identifies a microRNA OrchestratingPleiotropic Resistance to Targeted Therapy and T Cell Immunity in Melanoma的研究论文。该研究从全基因组水平系统性揭示了微小RNA（miRNA）在黑色素瘤“靶向-免疫”交叉耐药中的关键调控作用，为克服复杂耐药机制提供了全新视角和潜在治疗策略。

黑色素瘤治疗中的“交叉耐药”困境

黑色素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤之一，全球每年新发病例超过30万，死亡病例约6万。BRAF/MEK靶向治疗和PD-1/CTLA-4免疫检查点治疗虽显著改善了晚期患者的预后，但大量患者在治疗过程中先后或同时对靶向药物和免疫治疗产生耐药，形成所谓“交叉耐药”。一线治疗失败的患者往往对后续方案的应答率大幅下降，导致不可逆的疾病进展。然而，驱动这一多重耐药的上游分子机制，尤其是非编码RNA在其中的角色，长期以来悬而未决。

全基因组筛选锁定关键分子miR-18a

为系统解析miRNA在交叉耐药中的作用，研究团队自主构建了一款新型全基因组miRNA CRISPR敲除文库。该文库整合miRBase v21与FANTOM5数据库中的2,185条miRNA，共设计8,598条sgRNA，在覆盖广度和靶向精度上均显著优于已有文库。以BRAF V600E突变型黑色素瘤A375细胞为模型，团队开展了两套平行筛选：分别评估miRNA缺失对BRAF抑制剂维莫非尼（VEM）的耐药效应和对CD8⁺ T细胞杀伤的耐受效应。两套筛选的生物学重复性均较高（Spearman相关系数≥0.9）。正向选择分析发现，miR-18a在两套筛选中均显著富集，是同时关联靶向治疗耐药与免疫逃逸的关键候选分子。

后续验证表明，在A375、SK-MEL-28以及鼠源YUMM1.7细胞系中，miR-18a敲除均赋予细胞对VEM、MEK抑制剂及ERK抑制剂的显著耐药性，同时削弱CD8⁺ T细胞的杀伤效力；而重新引入miR-18a-5p或miR-18a-3p可大幅恢复药物敏感性和免疫易感性，证实了miR-18a的核心调控地位。

临床队列证实miR-18a下调与治疗耐药及不良预后密切相关

为深入探究miR-18a下调与黑色素瘤靶向和免疫治疗耐药的关系，研究团队首先构建了A375 VEM耐药株（A375-VR）和耐CD8⁺ T细胞杀伤株（A375-TR）。与亲本株相比，两种耐药细胞中miR-18a的表达均显著下调；而过表达miR-18a-mimic可显著逆转耐药表型。

进一步，团队整合了来自七个治疗队列的120对（61对靶向治疗，59对免疫治疗）黑色素瘤患者纵向RNA-seq和临床数据。系统性分析表明，在BRAFi/MEKi靶向治疗或抗PD-1/CTLA-4免疫治疗期间，miR-18a活性降幅越大，治疗应答越差、生存预后越不理想；miR-18a活性变化还与肿瘤浸润CD8⁺ T细胞比例呈显著正相关。

揭示“一箭双雕”的平行调控机制

转录组和单细胞测序分析提示，miR-18a缺失可能通过两条平行信号通路分别介导两种耐药表型：一方面通过Hippo信号通路影响靶向药物敏感性；另一方面通过TGF-β信号通路影响CD8⁺ T细胞杀伤效应。

机制研究表明，miR-18a通过两条平行的信号通路分别调控两种耐药表型：

1. 靶向治疗耐药——AJUBA/Hippo/YAP轴。 miR-18a-5p直接靶向Hippo通路负调控因子AJUBA。miR-18a缺失解除对AJUBA的抑制，导致LATS1/2激酶活性降低、YAP去磷酸化并核转位，激活促存活基因CTGF和CYR61的转录，驱动BRAF抑制剂耐药。裸鼠移植瘤模型中，miR-18a-5p mimics或YAP抑制剂（verteporfin、VT3989）联合VEM可显著抑制耐药肿瘤生长。

2. 免疫耐受——THBS1/CD47轴。miR-18a-5p同时直接靶向THBS1。miR-18a缺失使肿瘤细胞高表达THBS1，后者与CD8⁺ T细胞表面CD47结合，损害免疫突触形成，削弱T细胞杀伤活性。在C57BL/6小鼠同基因移植瘤模型中，瘤内注射miR-18a-5p mimics显著抑制肿瘤生长；单细胞测序证实TGF-β信号减弱、Thbs1–Cd47通讯降低、CD8⁺ T细胞浸润增加。CD47阻断抗体magrolimab同样可逆转miR-18a缺失引起的免疫逃逸。

综上，miR-18a作为上游枢纽，将肿瘤内在耐药信号与免疫微环境重塑统一于同一调控框架之下，实现了“一箭双雕”的平行调控。

上游调控因子的发现与临床验证

研究进一步发现，RNA结合蛋白 hnRNP A1 是miR-18a的关键上游调控因子，通过促进pre-miR-18a的加工成熟维持miR-18a水平。靶向药物或T细胞杀伤的治疗压力下，hnRNP A1表达下调，导致miR-18a降低，从而启动双重耐药通路。RIP实验与正反向救援实验一致支持“hnRNP A1→ miR-18a → AJUBA/THBS1”的单向调控级联。

在临床层面，在天津医科大学肿瘤医院 53例独立验证队列中，组织芯片免疫组化与原位杂交证实hnRNP A1高表达与miR-18a高表达显著相关（P = 6.1 × 10⁻¹³），为调控机制提供了临床佐证。

新的联合治疗策略与展望

基于上述发现，团队提出了针对多重耐药的潜在干预策略：恢复肿瘤内miR-18a表达，或联合使用YAP–TEAD抑制剂（verteporfin、VT3989）和CD47阻断抗体（magrolimab），有望同步逆转靶向药物耐药与免疫逃逸。该研究首次在全基因组水平系统描绘了miRNA介导黑色素瘤交叉耐药的分子框架，为开发新型联合治疗方案和预测性生物标志物奠定了基础。

图 miR-18a与黑色素瘤耐药机制模拟图

王朝研究员、刘昊天博士、王雪琪博士生、滕建谨硕士为文章的共同第一作者。李俊教授、黄丹丹教授和杨吉龙教授为文章的共同通讯作者。

原文链接：http://doi.org/10.1002/advs.202515158

制版人：十一

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