FSHW | 植物源天然产物AA通过抑制RANKL介导的RANK信号通路来抑制破骨细胞生成，并缓解卵巢切除术诱导的骨质流失

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Introduction

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构退化为特征的代谢性骨病，尤其在绝经后女性中高发，主要由雌激素减少导致破骨细胞活性增强。现有药物如双膦酸盐和RANKL抑制剂存在副作用，因此亟需开发天然、安全的替代疗法。

甾体生物碱是多种药用植物中的主要活性成分，具有广泛的生物活性。新发现的甾体生物碱AxillaridineA（AA）能否抑制破骨细胞分化并缓解卵巢切除所致小鼠骨质流失尚不明确。体外实验表明，AA通过下调破骨细胞分化相关标志基因、蛋白及转录调控因子（包括抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、c-Src、基质金属肽酶9（MMP-9）、组织蛋白酶K、活化T细胞核因子胞质1（NFATc1）和c-Fos）的表达，显著抑制核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞分化。其作用机制是通过阻断RANKL-RANK相互作用，抑制破骨前体细胞中RANKL介导的RANK信号通路（包括NF-κB、AKT和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活。体内实验显示，AA能显著抑制卵巢切除（OVX）小鼠的体重增加和血糖升高，且未对肝肾组织形态、重量及指数产生不良影响。AA通过抑制破骨细胞生成有效改善OVX小鼠骨质流失，显著降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）和Ⅰ型胶原C端肽（CTX-Ⅰ）水平，并显著抑制股骨中破骨细胞生成相关标志基因和蛋白的表达。综上，AA通过抑制RANKL介导的RANK信号通路来抑制破骨细胞生成，从而缓解卵巢切除所致小鼠骨质流失，有望用于骨质疏松等破骨细胞相关疾病的防治。

云南农业大学理学院李今博士（现为浙江药科职业大学食品学院、健康管理学院讲师）、云南农业大学盛军教授团队徐欢欢副教授课题组在本文中以RANKL诱导的RAW264.7细胞和去卵巢小鼠为模型研究了AxillaridineA（AA）对破骨细胞生成和卵巢切除诱导的骨丢失的抑制作用及其分子机制。

结果与讨论

AA抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞中的破骨细胞分化

为了研究AA对RAW264.7细胞活性的影响，在分别用浓度为100、200和400 nmol/L的AA处理细胞24、48或72 h后，首先进行了MTT检测。结果显示，本研究中所使用浓度的AA对RAW264.7细胞没有细胞毒性（图1B）。为了直接在体外研究AA对破骨细胞生成的影响，采用了破骨细胞分化的传统模型（RANKL刺激的RAW264.7细胞）。如图1C和D所示，RANKL刺激诱导了抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的多核破骨细胞的形成，而AA则显著且呈浓度依赖性地抑制了这一过程。因此，这些结果表明，AA在体外能够抑制由RANKL引发的破骨细胞生成。

图1 AA抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞中的破骨细胞分化

AA抑制破骨细胞生成相关的基因和蛋白表达

为了阐明AA对RANKL刺激的破骨细胞生成的抑制机制，作者检测了RAW264.7细胞中相关基因和蛋白质的表达水平。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析表明，AA显著且呈浓度依赖性地抑制了RANKL刺激下抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP，图2A）、c-Src（图2B）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9，图2C）的mRNA表达水平。此外，蛋白质印迹（westernblot）分析显示，AA显著抑制了RANKL刺激下抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b，图2D）、c-Src（图2E）和组织蛋白酶K（图2F）的蛋白质表达水平。这些结果表明，AA通过抑制破骨细胞生成相关基因和蛋白质的表达，抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化。

图2 AA抑制破骨细胞生成相关的基因和蛋白表达

AA抑制RANKL诱导的NFATc1和c-Fos的基因与蛋白表达

NFATc1和c-Fos作为2 个关键的破骨细胞生成转录因子，能够激活其靶基因。作者进一步探究了AA是否能够抑制RANKL刺激下RAW264.7细胞中NFATc1和c-Fos的表达。如图3A和3B所示，AA显著抑制了RANKL刺激下NFATc1和c-Fos的mRNA表达水平。同样，AA也显著抑制了RANKL刺激下NFATc1和c-Fos的蛋白表达水平（图3C和3D）。这些结果表明，AA通过抑制NFATc1和c-Fos的表达，抑制了RANKL诱导的破骨细胞生成。

图3 AA抑制RANKL诱导的NFATc1和c-Fos的基因与蛋白表达

AA抑制RANKL刺激的RAW264.7细胞中NF-κB信号通路

RANKL刺激的NF-κB信号通路在破骨细胞生成过程中有助于NFATc1和c-Fos的激活。因此，为了进一步阐明AA抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的机制，作者研究了AA是否能够抑制RANKL刺激下RAW264.7细胞中NF-κB信号通路的激活。蛋白质印迹分析显示，RANKL刺激在5 min时显著增加了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化水平（图4A）。正如预期的那样，在RANKL刺激的RAW264.7细胞中，与总的IKKα/β、总的IκBα和总的p65相比，AA显著降低了IKKα/β（图4B）、IκBα（图4C）和p65（图4D）的磷酸化水平。这些结果表明，AA抑制了RANKL刺激的NF-κB信号通路的激活。

图4 AA抑制RANKL刺激的RAW264.7细胞中NF-κB信号通路

AA抑制RANKL刺激的RAW264.7细胞中AKT和MAPK信号通路

除了NF-κB信号通路外，RANKL刺激的AKT和MAPK通路对于破骨细胞生成转录因子的初始诱导至关重要。作者通过蛋白质印迹分析进一步研究了AA对RANKL刺激的RAW264.7细胞中这些信号分子的影响。如图5A所示，RANKL刺激增加了AKT以及三种MAPK家族成员（包括JNK、p38和ERK1/2）的磷酸化水平。不出所料，在60 min内，与总AKT、总JNK、总p38和总ERK1/2相比，AA显著降低了RANKL刺激的RAW264.7细胞中AKT（图5B）、JNK（图5C）、p38（图5D）和ERK1/2（图5E）的磷酸化水平。这些结果表明，AA抑制了RANKL刺激的AKT和MAPK信号通路的激活。

图5 AA抑制RANKL刺激的RAW264.7细胞中AKT和MAPK信号通路

AA直接与RANKL结合并阻断RANKL-RANK相互作用

RANKL-RANK相互作用可激活包括NF-κB、AKT和MAPK通路在内的下游信号转导通路，并且是预防和治疗骨质疏松症的关键靶点。鉴于AA抑制了RANKL介导的RANK信号通路，作者推测AA可能直接破坏RANKL与RANK之间的相互作用。为验证这一点，本实验使用表面等离子体共振（SPR）分析检测了AA与RANKL以及RANK之间的直接相互作用。如图6A和6B所示，AA可直接与RANKL相互作用，但不与RANK相互作用。AA的结合常数（Ka）和解离常数（Kd）经计算分别为2.414×103 L/(mol·s)和7.856×10-2 s-1，与RANKL的结合亲和力（KD）经计算为3.255×10-5 mol/L。重要的是，基于SPR的“A-B-A”竞争试验表明，AA能够破坏RANKL-RANK相互作用（图6C）。综上所述，这些结果揭示了AA通过抑制RANKL-RANK相互作用以及RANKL介导的RANK信号通路来抑制破骨细胞生成（图6D）。

图6 AA直接与RANKL结合并阻断RANKL-RANK相互作用

AA对去卵巢（OVX）小鼠体重、血糖、器官组织形态、器官重量及器官指数的影响

基于在体外实验中取得的有前景的结果，作者进一步利用去卵巢小鼠模型探究了AA是否能够通过抑制破骨细胞生成来预防骨量丢失。如图7A和7B所示，AA处理显著抑制了去卵巢诱导的小鼠体重增加和血糖升高。此外，苏木精-伊红（H&E）染色显示，AA处理对去卵巢小鼠肾脏和肝脏的组织形态没有显著影响（图7C）。同样地，在任何一组中，肾脏和肝脏的重量（图7D和7F）以及指数（图7E和7G）均未观察到差异。这些结果表明，在所测试的剂量下，AA处理对这些小鼠没有产生副作用。

图7 AA对去卵巢（OVX）小鼠体重、血糖、器官组织形态、器官重量及器官指数的影响

AA通过抑制破骨细胞生成来改善去卵巢（OVX）诱导的骨量丢失

正如预期的那样，股骨组织的苏木精-伊红（H&E）染色表明，由于小梁骨面积增加，AA处理显著预防了去卵巢诱导的骨量丢失（图8A）。有趣的是，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，由于股骨中TRAP阳性细胞减少，AA处理显著抑制了去卵巢小鼠的破骨细胞分化。此外，与去卵巢组相比，接受AA处理的去卵巢小鼠血清中的抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）和Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（CTX-Ⅰ）活性（图7E）显著降低（图8C和8E）。然而，与去卵巢组相比，AA处理并未改变去卵巢小鼠血清中核因子κB受体活化因子配体（RANKL）（图8D）、I型前胶原氨基端前肽（PINP）（图8F）、骨保护素（OPG）（图8G）和骨钙素（OCN）（图8H）的水平。胫骨组织的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，去卵巢诱导的核因子活化T细胞胞浆蛋白1（NFATc1）（图9A）、c-Fos（图9B）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（图9C）、c-Src（图9D）、组织蛋白酶K（cathepsinK）（图9E）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）（图9F）和β3整合素（β3-Integrin）（图9G）的mRNA表达水平因AA处理而受到显著抑制。同样，胫骨组织的蛋白质印迹分析进一步表明，AA处理显著降低了去卵巢小鼠中破骨细胞生成相关标记蛋白的表达水平，包括NFATc1、c-Fos和TRACP-5b（图9H-K）。总之，这些结果表明，AA通过抑制破骨细胞生成改善了去卵巢诱导的骨量丢失。

图8 AA通过抑制破骨细胞生成来改善去卵巢（OVX）所导致的骨量流失

图9 AA抑制去卵巢（OVX）小鼠体内与破骨细胞生成相关的标记基因和蛋白质的表达

Conclusion

综上所述，AA能够通过抑制RANKL介导的RANK信号通路来抑制破骨细胞生成，从而减轻小鼠因卵巢切除而导致的骨量流失。因此，这种药用植物源天然化合物AA具有潜在的应用价值，可用于预防和治疗与破骨细胞相关的疾病如骨质疏松症。

作者简介

盛军，二级教授，日本大阪大学博士，原卫生部长春生物制品研究所所长、原云南农业大学校长、云南省高原特色农业产业研究院院长；现任中国微生物学会常务理事，云南省微生物学会理事长，教育部高等学校教学指导委员会委员。长期从事食药资源组学研究、功能机理解析和成果转化，在植物基食品组学、功能活性成分解析以及精准营养产品上取得系列成果。破译特色植物资源基因组，构建了国际上首个食药同源资源跨组学数据；创建跨界物种植物多酚生物合成大数据，揭示植物基食物多酚调节代谢免疫机制。建立了植物基功能组分定向发酵富集技术，创新集成工艺装备，建成普洱茶、辣木、核桃等深加工技术体系，研制系列新产品，并实现产业化推广应用，产生了显著的经济效益和社会效益。获授权专利73 件，发表论文309 篇（SCI论文160篇），以第一或通信作者在Science、NatureCommunications、MolecularPlant等杂志上发表论文138 篇，出版学术著作4 部。获吉林省科技进步一等奖、云南省科技进步一等奖、云南省科技进步特等奖、云南省科学技术杰出贡献奖、世界茶业大会普洱茶特别贡献奖；入选云南省科技领军人才、首批国家跨世纪百千万人才工程国家级人选、全国优秀科技工作者。

第一作者简介

李今，女，工学博士，现为浙江药科职业大学食品学院、健康管理学院讲师，主要研究方向为食品及药食同源物质中天然化合物的生物活性研究，已在国内外学术期刊发表论文14 篇，其中以第一作者或共同第一作者发表论文7 篇（SCI收录6 篇，含TOP期刊论文4 篇）。

通信作者简介

徐欢欢，男，博士，副教授，硕士研究生导师，云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室副主任，云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，华东师范大学访问学者，研究方向为食药同源天然产物生物活性及分子机制，研究疾病集中于类风湿性关节炎、骨质疏松、皮肤光老化、衰老、肿瘤等，作为负责人构建了天然化合物实体库（大于3 600 个），能熟练运用分子互作技术（SPR/BLI/ITC）进行相关药物筛选及开发，主持国家自然科学基金青年科学基金项目1 项、省部级项目5 项，现以第一/通信作者（含共同）身份发表SCI收录论文26 篇，授权实用新型专利4 件，申报发明专利4 件。

刘提提，女，博士，副教授，云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室青年骨干成员，主要从事食药资源天然化合物的生物学效应及分子机制研究，尤其对以TNF家族RANKL、TNF-α等为靶点研究天然化合物的抗骨质疏松及抗类风湿性关节炎的作用和机制的理解较为深刻，主持云南省科技计划项目2 项，以第一/通信作者（含共同）身份发表SCI收录论文10 篇（其中Top期刊论文8 篇），IF>5分SCI收录论文9 篇。

Axillaridine A suppresses osteoclastogenesis and alleviates ovariectomy-induced bone loss via inhibition of RANKL-mediated RANK signaling pathways

Jin Lia,b,1, Jing Xub,c,1, Zhe Jiangb,c,1, Meiyan Duanb,c, Yingqi Yinb,c, Zemin Xiangb,c, Xuanjun Wangb, Jun Shengb, Titi Liua,b,*, Huanhuan Xua,b,*

a College of Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

b Key Laboratory of Pu-er Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

c College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

1 These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

Abstract

Steroidal alkaloids are the main active components in many medicinal plants and exhibit diverse biological activities. Axillaridine A (AA) is a newly discovered steroidal alkaloid. However, whether AA could suppress osteoclastogenesis and alleviate ovariectomy-induced bone loss in mice remains unknown. In vitro, AA significantly suppressed the receptor activator of nuclear factor-‍κB (NF-‍κB) ligand (RANKL)‍-induced osteoclast differentiation via downregulating the expression of osteoclastogenesis-related marker genes, proteins, and transcriptional regulators, including tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), c-Src, matrix metallopeptidase-9 (MMP-9), cathepsin K, nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 1 (NFATc1), and c-Fos. This was achieved by blocking RANKL-RANK interaction and inhibiting RANKL-mediated RANK signaling pathways, including NF‍-‍κB, AKT, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in osteoclast precursors. In vivo, AA significantly inhibited the ovariectomized (OVX)‍-induced body weight gain and blood glucose increase in mice. AA did not adversely affect the histomorphologies, weights, and indices of the kidney and liver in OVX mice. AA effectively ameliorated bone loss in OVX mice by inhibiting osteoclastogenesis. AA significantly inhibited the serum levels of tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP-5b) and C-telopeptide of type I collagen (CTX-‍I). AA significantly inhibited the OVX-induced expression of osteoclastogenesis-related marker genes and proteins in the femur. In summary, AA alleviates ovariectomy-induced bone loss in mice by suppressing osteoclastogenesis via inhibition of RANKL-mediated RANK signaling pathways and could be potentially used for the prevention and treatment of osteoclast-related diseases such as osteoporosis.

Reference:

LI J, XU J, JIANG Z, et al. Axillaridine A suppresses osteoclastogenesis and alleviates ovariectomy-induced bone loss via inhibition of RANKL-mediated RANK signaling pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(6): 9250397. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250397.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、皖西学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“ 第六届食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到） 在 中国 安徽 合肥 召开。

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