小胶质细胞 NLRP3 焦亡释 IL-1β，抑神经发生，加重糖脑认知障碍

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糖尿病脑病(DE)是糖尿病引起的一种重要并发症，可改变中枢神经系统功能。DE表现为行为和认知的改变，伴随着大脑内的神经化学和结构改变，海马体受到显著影响。虽然DE的概念最初是由Nielsen在20世纪60年代提出的，但其病理生理机制仍未完全阐明。有证据表明，糖尿病患者患认知障碍的风险更高，这是一种与成年海马区神经发生减少有关的行为缺陷。

1.DE小鼠的认知能力受损

本研究采用高脂饮食（HFD）联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）构建T2DM小鼠模型；模型构建成功12周后，通过Morris水迷宫检测小鼠空间学习与记忆能力。图1A为该实验时间线示意图。

与对照组小鼠相比，DE小鼠经高脂饮食喂养后体重显著上升（图1B）。同时，STZ 注射后，DE小鼠随机血糖（RBG）水平明显升高（图1C）。DE小鼠存在葡萄糖耐量受损，表现为腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）各时间点血糖值升高（图1D）、血糖-时间曲线下面积（AUC）增大（图1E）；且胰岛素敏感性下降，表现为腹腔胰岛素耐量试验（IPITT）各时间点血糖升高（图1F）、血糖 - 时间曲线下面积增加（图1G）。

对照组与DE组小鼠游泳速度无显著差异（图1H），且DE小鼠逃避潜伏期显著延长（图1I、L）。空间探索阶段，DE小鼠穿越平台次数减少（图1J、L），目标象限停留时间缩短（图1K）。综上结果证实，DE模型小鼠存在明显的空间学习与记忆功能损伤。

图1 DE小鼠表现出空间学习和记忆功能降低。

2.DE小鼠海马区DG区神经发生减少

鉴于海马区相关的行为缺陷通常与AHN缺乏症相关，我们继续研究DE小鼠海马区DG区的神经发生活动。神经前体细胞可以用巢蛋白和SOX2标记，增殖细胞可以用Ki67标记。结果显示，DE组与Ctrl组相比，DG区Nestin+(图2A)、SOX2+(图2B)和Ki67+细胞(图2C)的数量显著减少。此外，免疫荧光分析显示DCX+细胞(图2D)和BrdU+/DCX+细胞显著减少，表明DG区神经干细胞的分化受到抑制。综上所述，DE小鼠海马DG区的AHN受损，表现为神经前体细胞数量减少和神经干细胞的增殖分化。

图2 DE小鼠DG区AHN减少。

3.DE小鼠海马区小胶质细胞下垂增多

接下来，我们研究了DE小鼠是否表现出NLRP3依赖的小胶质细胞下垂。Western印迹分析显示，DE小鼠海马组织中NLRP3、Caspase1-p20、N-GSDMD和IL-1β蛋白水平上调(图3A)。主要执行蛋白和关键促炎细胞因子升高，提示DE小鼠海马区NLRP3依赖性下垂加重。用免疫荧光的方法，我们发现IBA1与NLRP3(图3B)、Caspase-1(图3C)、GSDMD(图3D)和IL-1β(图3E)在DE小鼠的海马区共定位显著增加，表明嗜热症相关蛋白的表达增加主要发生在小胶质细胞。这些结果表明，小胶质细胞中NLRP3炎症体的形成导致了DE小鼠海马DG区caspase-1、GSDMD和IL-1β的激活，并加重了下垂的程度。

图3 DE小鼠海马区小胶质细胞下垂加重。

4.小胶质细胞中NLRP3的表达对小鼠认知功能的影响

为了确定NLRP3在小胶质细胞中的表达是否是DE小鼠认知功能下降的关键危险因素，并探讨其调节机制，我们构建了带有特异性启动子F4/80P的AAV-NLRP3和AAV-shNLRP3来特异性地调节小胶质细胞中NLRP3的表达。图4A包含这一实验的示意图，所使用的病毒载体序列如图4B所示。注射AAV-F4/80-NLRP3后，Ctrl小鼠海马区NLRP3 mRNA水平(图4C)和蛋白表达(图4D)显著上调。DE小鼠海马区NLRP3 mRNA水平(图4C)和蛋白表达(图4D)显著下调，证实了病毒感染的有效性。

病毒注射4周后，进行MWM检测。四组小鼠的游泳速度在统计学上没有显著差异(图4e)。Ctrl+AAV-NLRP3组在学习期间的逃避潜伏期显著延长(图4F，I)。在学习期间，这组的跨平台次数明显减少(图4G，I)，在目标象限花费的时间也减少(图4H)。相反，DE+AAV-shNLRP3组的逃逸潜伏期显著缩短(图4F，I)，跨越平台的次数增加(图4G，I)，目标区持续时间(图4H)更长。这些结果表明，上调小胶质细胞中NLRP3的表达会损害Ctrl小鼠的空间学习记忆功能，而下调小胶质细胞中NLRP3的表达则可以改善DE小鼠的认知功能障碍。

图4 小胶质细胞中NLRP3的表达对小鼠认知功能的影响。

5.NLRP3在小鼠小胶质细胞中的表达对AHN的影响

为了研究NLRP3在小胶质细胞中的表达对神经发生的影响，我们检测了海马DG区的AHN。我们的免疫荧光分析结果显示，Ctrl+AAV-NLRP3小鼠海马DG中Nestin+(图5A)、SOX2+(图5B)、Ki67+(图5C)和DCX+细胞(图5D)的数量显著减少。相反，DE+shNLRP3小鼠海马DG中Nestin+(图5A)、SOX2+(图5B)、Ki67+(图5C)和DCX+细胞(图5D)的数量显著增加。综上所述，这些发现推测NLRP3在小胶质细胞中的表达对AHN具有调节作用。小胶质细胞内NLRP3表达上调导致Ctrl小鼠AHN受损，而小胶质细胞内NLRP3表达下调可减轻DE小鼠AHN的损伤。

图5 NLRP3在小胶质细胞中的表达与DG区AHN相关。

6.NLRP3对DE小鼠海马区小胶质细胞下垂的调节作用

为了进一步阐明NLRP3导致AHN损伤的可能机制，我们检测了海马区的小胶质细胞下垂。免疫荧光分析显示，Iba1与NLRP3(图6A)、Caspase-1(图6B)、GSDMD(图6C)和IL-1β(图6D)在海马区的共存显著增强，这反映了小胶质细胞松弛的恶化。Caspase-1-p20、N-GSDMD和IL-1β的Western印迹结果进一步证实了NLRP3对下垂的调节作用，如图6E所示。Ctrl+AAV-NLRP3组Caspase-1-p20、N-GSDMD和IL-1β的表达水平显著升高。在DE+AAV-shNLRP3组，随着NLRP3基因的下调，caspase-1-p20、N-GSDMD和IL-1β的表达水平发生逆转(图6E)。这些结果提示，海马区小胶质细胞中的NLRP3可能通过调节小胶质细胞下垂和神经炎症参与了DE的发病。

图6 NLRP3对海马区小胶质细胞下垂的调节。

7.高糖培养的BV2细胞NLRP3表达和IL-1β分泌增加

这个实验的总体设计如图7A的示意图所示。用ELISA测定细胞培养上清液中IL-1β或IL-18的水平。如图7B所示，培养上清液中IL-1β含量随着葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长而增加。图7C-E所示的Western印迹分析显示，不同浓度的葡萄糖培养24小时的BV2细胞中，NLRP3、caspase-1-p20和N-GSDMD蛋白的表达没有统计学差异。BV2细胞在含75 mM和100 mM葡萄糖的培养液中培养48h后，NLRP3、caspase-1-p20和N-GSDMD的表达水平均显著升高。综合这些结果表明，随着葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长，BV2细胞对NLRP3依赖的下垂和IL-1β的释放增加。

图7 小胶质细胞下垂在体外糖尿病模型中增加。

8.小胶质细胞释放IL-1β介导血管紧张素转换酶损伤

我们利用BV2和C17.2细胞系建立了体外模型。实验程序的总体设计如图8A所示，免疫荧光分析显示，与NC组相比，IL-1β组和HG-CM组BrdU+、Ki67+细胞和DCX+细胞的百分比显著降低(图8B-D)，表明细胞的增殖和分化受到抑制。重要的是，在HG-CM中加入IL-1RA可以增加细胞的增殖和分化率(图8B-D)。这些结果表明，IL-1RA和抗IL-1β对IL-1β的损伤具有相似的保护作用。综上所述，高糖诱导小胶质细胞释放IL-1β，作用于神经干细胞，从而损害ANN。

综合以上所有结果可知：小胶质细胞NLRP3依赖性焦亡可通过释放IL1β 抑制成年海马神经发生（AHN）。高糖环境会上调NLRP3表达，进而加重小胶质细胞焦亡、促进IL1β大量释放，最终造成成年海马神经发生障碍与认知功能损伤。抑制小胶质细胞NLRP3的表达，可显著改善成年海马神经发生水平，有效缓解认知功能障碍。

图8 IL-1β对C17.2细胞增殖和分化的影响。

结论

综上所述，本研究证实：糖尿病脑病（DE）小鼠海马组织中小胶质细胞NLRP3 依赖性细胞焦亡水平显著升高，该过程可通过释放白细胞介素- 1β（IL-1β）抑制成年海马神经发生（AHN），最终引发认知功能损伤。特异性下调小胶质细胞中NLRP3的表达，可减少IL-1β分泌，恢复糖尿病脑病小鼠的成年海马神经发生能力，进而改善认知功能。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA201 Morris 水迷宫

Morris水迷宫由Richard G. M. Morris于1981年创立，旨在通过“隐藏平台+远端视觉线索”环境，排除气味、触觉等局部干扰，专门评估啮齿类动物海马依赖的空间学习与记忆能力。该范式验证了动物可利用空间关系构建“认知地图”，从而推动了空间记忆理论研究，并成为阿尔茨海默病、脑损伤等领域的经典行为学工具。

此实验的原理基于动物厌恶水环境、本能寻找逃生平台的行为范式，通过记录动物利用远端视觉线索定位隐藏于水面下平台的过程，评估其空间学习与记忆能力。在训练阶段，动物逐渐习得平台位置，表现为逃避潜伏期缩短、路径优化；在测试阶段，撤去平台后通过观察动物在原平台象限的停留时间与穿台次数，反映其记忆保留程度。该任务依赖完整海马结构与NMDA受体介导的突触可塑性，因此被广泛用于研究学习记忆的神经机制及神经退行性疾病模型。

Morris水迷宫是评价啮齿类动物空间学习与记忆能力的金标准，广泛用于神经疾病模型的认知功能评估及干预策略筛选。它采用“逃离水环境”的统一动机，重复性高，且结合机器学习可精细化分析搜索策略，具有重要的应用价值。