造血干细胞磁珠分选方案及实验流程（CD34 、Lineage Cell Depletion），细节干货满满！

（来源：优宁维抗体专家）

关于磁珠分选实验，您务必要知道的关键点（耐心看完，后附分选实操案例）

分选前准备

确认磁珠：根据您的实验种属、样本来源、目的细胞marker选择适配的磁珠。

确认分选策略： 根据您实验的指标类型以及后续需求选择对应的分选策略。

阳性分选：

目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。该方法常用于以下情况：

1. 分选表达单一表面标志物的细胞分选（如CD3+,CD4+,CD8+细胞）

2. 稀有细胞的分选 (如循环肿瘤细胞CTC、肿瘤浸润淋巴细胞TIL)

3. 表达较弱的表面标志物细胞分选（如CD133+细胞）

4. 去除特定细胞群分选（如TCRαβ+T去除、CD45RA+细胞去除）

阴性分选/去除分选：

非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。该方法常用于以下情况：

1. 去除特定非目的细胞群

2. 缺乏目的细胞特异性表面标志物的分选（如某些肿瘤细胞、神经元）

3. 磁珠分选后需进一步通过阳性选择分选细胞亚群（CD4+CD25+Treg）

4. 分选后的细胞表面不可带有任何磁珠标记

顺序分选：

联合使用两种分选策略，例如先阴选后阳选，或先使用可剪切的REAlease磁珠后进行阳性分选。该方法常用于以下情况：

1. 同步分离两种特定细胞亚群：首先通过阴性分选去除共同杂质细胞，随后利用阳性分选将剩余的目标细胞亚群分开

2. 目标抗原在非目的细胞上存在交叉表达，导致直接阳性分选纯度不足

3. 要分选极稀有的细胞，通过预富集步骤提高目的细胞的纯度和得率

确认分选柱：对于不同类型的分选柱选择，关键是不要超过推荐的细胞量，否则会使柱子过载，导致分选效果不佳。可根据您的细胞总数和目标细胞数、分选策略选择对应的分选柱，可参考下图。对于具体使用的磁珠，参考每个磁珠说明书附的数据表，进行分选柱的选择。

相关产品货号:

确认分选平台：根据您的分选柱，选择适配的分选平台。

相关产品货号:

准备分选缓冲液：

方案一

将MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）按照1:20配置，作为分选buffer；分选缓冲液需放置4°预冷。

方案二

如您的细胞对于叠氮化钠成分不敏感，可直接选择autoMACS Running Buffer（#130-091-221）进行分选。该buffer内含有少量的叠氮化钠，对某些敏感细胞，例如神经细胞造成影响。

方案三

含0.5%BSA、2mM EDTA的PBS，配置后调整PH至7.2，需去除气泡，气泡可能导致分选柱堵塞。配好的buffer可先静置，也可使用真空抽滤、超声消除气泡。

细胞计数和活性检测：

分选前需要检测单细胞样本的细胞量及细胞活率，通过细胞量计算您的磁珠添加量；建议起始单细胞活率达到85%以上再进行磁珠分选，会得到较为理想的实验结果。

您可以选择对应产品提升样本的初始活性：

细胞筛网（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462）、

碎片去除试剂（Debris Removal Solution#130-109-398 ）、

死细胞去除磁珠（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）、

裂红试剂（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183）。

分选过程中

一、

磁珠篇

美天旎磁珠为胶体溶液，不会沉淀，实验前不用摇晃即可直接使用。

磁珠说明书中推荐的磁珠标记的体积适用于1×107的细胞。当您的总细胞量少于107细胞，需按照说明使用相同的体积。当超过107细胞数，将所有试剂体积和总体积按照相应比例增加。

磁珠孵育温度为2-8℃，建议在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上会使磁珠结合效率变差。提高温度或延长孵育时间均可能导致非特异性磁性标记。

二、

分选篇

分选柱在加样前需使用缓冲液润洗，润洗分选柱的缓冲液请事先回温至操作环境温度，防止预冷的缓冲液润洗室温分选柱，导致分选柱中形成小气泡，使分选效果不佳。

整个分选过程要尽量快速操作，保持细胞处于低温，分选过程中使用的分选缓冲液需预冷，可防止抗体包裹在细胞表面以及非特异性的磁性标记。

每一次向分选柱中加液均需等到分选柱中的液体流空，最后一滴在分选柱中不滴出时，再进行下一步加液。

收集分选柱中磁珠标记的细胞液，需要将分选柱从磁场中拿下，放至收集管上，向分选柱加入缓冲液后立即进行栓塞按压；分选柱栓塞只能按压一次，请勿反复操作。

分选柱为一次性耗材，请勿重复使用。

分选结束后

利用流式检测目的细胞占比及分选后细胞活性，计算出分选纯度和分选得率，您可参考以下公式进行计算：

分选纯度=分选后目的细胞总数量/分选后所得所有细胞总数量

分选得率=分选后目的细胞总数量/分选前目的细胞总数量

注意：分选前目的细胞总数量=标记后未上柱子前的细胞悬液*目的细胞占比

CD34是human HSC阳性分选的理想和通用金标准指标。而如果从小鼠骨髓样本中分离HSCs谱系阴性细胞。可以选择Direct Lineage Cell Depletion Kit和indirect Lineage Cell Depletion Kit；可以有效地耗尽成熟的造血细胞，包括T细胞，B细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞，红细胞及其定向祖细胞。

为您详细解读这2个造血干细胞应用分选实例，优质干货来袭，照搬流程直接做实验！

CD34阳性细胞分选: CD34 MicroBead Kit UltraPure, human

造血干细胞Lineage Cell去除分选: Lineage Cell Depletion Kit

CD34细胞分选： CD34 MicroBead Kit UltraPure, human（#130-100-453）

磁性分选耗材

● Mini MACS分选器（#130-042-102）或Midi MACS分选器（#130-042-302）

●MACS MultiStand（#130-042-303）

●MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置

●（可选）Dead Cell Removal Kit (#130-090-101)可选择死细胞去除试剂盒用于去除死细胞

●（可选）Pre-Separation Filters 30μm预分离滤器（#130-041-407）磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱

实验步骤：

一、

磁珠标记CD34+细胞

1.细胞计数；

2. 细胞悬液300×g离心10分钟，弃上清；

3. 用预冷的分选缓冲液重悬细胞沉淀，每1×10⁸总细胞使用300 μL缓冲液；

4. 每1×10⁸细胞添加100 μLFcR Blocking试剂和100 μL CD34 MicroBeads；

5. 混匀，于2-8℃孵育30min；

6. （可选）添加染色抗体，例如CD34 Antibody，anti - human，PE（识别QBEND/10以外的另一个表位），在冰箱（2-8°C）中避光孵育5分钟。

7. 每1×10⁸个细胞加入5-10 mL分选缓冲液洗涤细胞，300×g离心10分钟，弃上清；

8. 添加分选缓冲液，调整溶液体积至500 μL（注：500 μL体积最大重悬至1×10⁸细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。

注：如用 LD分选柱去除细胞时，每1.25×10⁸个总细胞用500μL缓冲液重悬。

二、

磁珠分离CD34+细胞

1. 将分选柱放入对应的MACS分选器的磁场中；

2. 用适量缓冲液润洗分选柱，等到分选柱中液体排空后，再进行下一步骤（MS分选柱使用500 μL分选缓冲液润洗；LS分选柱使用3 mL分选缓冲液润洗）；

3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集的流穿细胞液为未被标记的非CD34+细胞；

4. 分别用分选缓冲液清洗柱子三次（MS分选柱使用500 μL分选缓冲液清洗3次；LS分选柱使用3 mL分选缓冲液清洗3次），收集未被标记的细胞；

5. 从分选器中取出分选柱，将其放到合适的收集管上；

6. 吸取适量的缓冲液（MS：1 mL；LS：5 mL），加到分选柱中，立即将栓塞推入分选柱中，冲洗出磁珠标记的细胞，即为CD34+细胞；

7. （可选）为了提高CD34+细胞的纯度，冲洗出的细胞可用MS或LS分选柱再次富集。用新的分选柱按照第1-6步重复磁珠分选步骤即可。

造血干细胞Lineage Cell去除分选：Lineage Cell Depletion Kit mouse（# 130-090-858）

磁性分选耗材

● Mini MACS分选器（#130-042-102）或Midi MACS分选器（#130-042-302）

●MACS MultiStand（#130-042-303）

●MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置

●（可选）Dead Cell Removal Kit (#130-090-101)可选择死细胞去除试剂盒用于去除死细胞

●（可选）Pre-Separation Filters 30μm预分离滤器（#130-041-407）磁珠标记前去除细胞团，防止堵塞分选柱

实验步骤：

一、

磁珠标记细胞

1. 细胞计数；

2. 细胞悬液300×g离心10分钟，弃上清；

3. 细胞重悬，每1×10⁷细胞添加40μL预冷分选缓冲液；

4. 每1×10⁷细胞添加10 μL Biotin-Antibody混合液；

5. 混匀，于4-8℃孵育10min；

6. 每1×10⁷细胞添加30 μL分选缓冲液；

7. 每1×10⁷个细胞加入20μL Anti-Biotin磁珠；

8. 混匀，于4-8℃孵育15min；

9. 每1×10⁷个细胞加入1-2 mL分选缓冲液洗涤细胞，300×g离心10分钟，弃上清；

10. 添加分选缓冲液，调整溶液体积至500 μL（注：500 μL体积最大重悬至1×10⁸细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。

二、

磁珠分离细胞

1. 将分选柱放入对应的MACS分选器的磁场中；

2. 用适量缓冲液润洗分选柱，等到分选柱中液体排空后，再进行下一步骤（MS分选柱使用500 μL分选缓冲液润洗；LS分选柱使用3 mL分选缓冲液润洗）；

3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集的流穿细胞液为未被标记的细胞，即为富集后的造血干细胞谱系阴性细胞；

4. 分别用分选缓冲液清洗柱子三次（MS分选柱使用500 μL分选缓冲液清洗3次；LS分选柱使用3 mL分选缓冲液清洗3次），将流出物收集在与步骤3的流出物相同的管中。这部分代表富集的造血干细胞谱系阴性细胞；

5. （可选）从分选器中取出分选柱，将其放到合适的收集管上；冲洗出未被磁珠标记的细胞，即为磁性标记造血干细胞谱系阳性细胞。

以上就是两款造血干细胞细胞磁珠分选的实验流程！想了解更多关于造血干细胞相关的磁珠产品，小优为您总结了造血干细胞分选产品合集：

造血干细胞分选：

阳性分选：货号130-100-453 CD34 MicroBead Kit UltraPure,human

阳性分选：货号130-100-830 CD133 MicroBead Kit-Hematopoietic Tissue, human

阳性分选：货号130-123-124 Anti-Sca-1 MicroBead Kit (Vio®Bright FlTC), mouse

阳性分选：货号130-092-924 CD105 MultiSort Kit (PE),mouse

阳性分选：货号130-091-224 CD117 MicroBeads, mouse

阳性+阴性分选：货号130-114-822 CD34+CD38- Cell lsolation Kit.human

阴性分选：货号130-092-211 Lineage Cell Depletion Kit.human

阴性分选：货号130-090-858 Lineage Cell Depletion Kit.mouse

参考文献:

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