武汉大学最新Nature！

众多遗传疾病源于基因序列的特定突变，理论上可通过向致病基因中插入正常功能拷贝来实现“一劳永逸”的修复。然而，现有的基因插入工具面临严峻挑战：依赖DNA双链断裂的修复途径效率低下且易产生非预期突变；而基于整合酶或转座酶的策略则需要额外蛋白组分，递送复杂且插入效率随片段增长急剧下降。如何在不需要双链断裂和外源酶的条件下，实现大片段DNA的高效、精准、可编程插入，是该领域长期悬而未决的难题。

2026年4月22日，武汉大学医学研究院、免疫与代谢前沿科学中心张楹教授与殷昊教授团队在《自然》（Nature）杂志在线发表了题为“Quadruple pegRNA enables programmable and efficient large genomic insertion”的研究论文。该研究首次报道了一种名为QuadPE（四重引导编辑）的新型基因插入系统，利用四个经工程化设计的引导RNA（pegRNA）协同作用，在不依赖DNA双链断裂、整合酶或转座酶的情况下，实现了长达26 kb外源DNA片段的高效、精准、可编程插入。

研究团队从先前基于成对pegRNA的插入工作出发，提出一个创新构想：用一对pegRNA在基因组靶点产生3'单链悬垂（flap），另一对pegRNA同时在供体DNA上生成互补悬垂，二者通过序列互补退火，引导供体DNA定向整合至基因组。他们系统筛选了24种基因组-供体组合方式，发现采用“PAM-out”构型（切割位点朝外）的基因组靶向pegRNA与采用环形供体、带有互补悬垂设计的cV6组合效率最优，命名为QuadPE。

进一步优化表明：30个核苷酸长度、约50% GC含量的悬垂设计最为高效；将四个pegRNA表达元件两两合并于两个载体上，与四个独立载体效率相当。利用优化后的QuadPE，研究团队在HEK293T、K562等6种细胞系的14个基因组位点上，成功插入了1.6 kb至26 kb不等的DNA片段。对于9.5 kb的插入，效率最高可达约60%。与当前先进的整合酶介导系统（eePASSIGE）和转座酶介导系统（evoCAST）相比，QuadPE对9.5 kb片段的插入效率分别提高了11倍和12倍。

尤为重要的是，QuadPE在非分裂细胞中展现出独特优势。细胞周期阻滞实验表明，当两个基因组靶向pegRNA的间距控制在20–112 bp时，QuadPE介导的插入效率不受G1期或G1/S期阻滞影响。在原代小鼠神经元（已退出细胞周期的有丝分裂后细胞）中，QuadPE实现了约4.6 kb片段最高12.5%的插入效率。在激活的人原代T细胞中，通过化学修饰的pegRNA与mRNA递送，QuadPE在TRAC位点达到了51%的插入效率。全基因组脱靶检测和Digenome-seq分析证实，QuadPE的脱靶插入事件及非特异性切割均极低，展现出高特异性。

该研究还通过恢复GFP报告基因功能验证了QuadPE的实用性：在K562细胞中，携带CMV启动子-EGFP的9.5 kb环形供体经QuadPE整合后，24天后仍可检测到约33%的GFP阳性细胞；采用无启动子、依赖内源AAVS1启动子的剪接受体-GFP策略，PAM-out构型同样获得约15%的GFP阳性率。

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