类杆菌在自闭症队列增加，以性别依赖的方式诱导小鼠与自闭症变化

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自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育状况，其定义是社交沟通减少，存在重复或刻板印象的行为。最近的证据表明，肠道-脑轴在神经发育中可能是重要的，特别是在ASD中可能发挥作用。以前在ASD中检测特定细菌种群的啮齿动物研究集中在揭示ASD啮齿动物模型在成年期的生物失调，随后进行微生物组治疗。然而，很少有研究通过在发育过程中对ASD队列中增加的相同种群的小鼠进行治疗来模拟ASD患者个体微生物组的特定变化。这是必要的，考虑到ASD是一种神经发育状况，因此需要确定微生物组对ASD相关行为的发育影响。

1.确定与ASD相关的微生物组组成的可能差异

为了确定与自闭症相关的微生物组组成的可能差异，我们对42名非同胞对照和96名以色列自闭症患者的粪便微生物组样本进行了16S rRNA扩增序列测定。年龄、性别差异无统计学意义。比较不同组之间的β多样性(样本之间)，显示出对照组和自闭症样本之间的显著差异(图1A，B)。用Faith的系统发育距离(PD)进行的比较表明，自闭症样本的多样性显著增加(图1C)。这些初步分析支持ASD患者微生物群多样性的差异。

图1 根据ASD的诊断比较微生物组的β和α多样性。

2.在年龄和性别作为协变量的情况下确定分类群的差异

为了确定分类群中的差异，同时考虑年龄和性别作为协变量，我们分析了一般线性模型，同时将饮食因素作为随机效应考虑在内。饮食习惯的纳入对类杆菌(图2A)和类杆菌(图2B)的统计意义没有影响。因此，这些细菌的变化与自闭症的诊断直接相关，与饮食无关。为了可视化类杆菌在整体微生物组特征中作为变异源的作用，我们重新绘制了主坐标分析(PCoA)图，以类杆菌的水平为标识符(图2C)。

ASD患者体内类杆菌数量的增加最初是令人惊讶的，因此，为了了解脆弱芽孢杆菌在关键发育窗口期的存在是否会引发ASD相关行为，我们对新生(P0.5)无特定病原体(SPF)的C57小鼠一次性灌胃脆弱芽孢杆菌或载体(PBS)，然后确定脆弱芽孢杆菌在肠道中的成功定植和成年后的行为表型。

图2 ASD样本中差异丰富的微生物门和属。

3.脆性芽孢杆菌感染新生仔鼠后肠道微生物群的检测

两周后，脆弱芽孢杆菌感染的动物在检测β多样性时显示出与对照小鼠不同的微生物群组成(图3A)。此外，通过定量聚合酶链式反应测定，脆弱杆菌处理组的雄性和雌性小鼠的脆弱芽孢杆菌的相对丰度都显著高于对照小鼠(图3B)。然而，在8周后没有观察到这些差异(图3C，D)。因此，脆弱芽孢杆菌的治疗在治疗后两周会导致细菌水平的强劲上升，但这些水平在成年后会下降。

图3脆性芽孢杆菌感染新生仔鼠后肠道微生物群的检测。

4.脆弱芽孢杆菌治疗的雄性小鼠成年期重复行为的失调

为了确定早期服用脆弱芽孢杆菌是否对成年后的行为有长期影响，对8周大的脆弱芽孢杆菌治疗小鼠和对照小鼠进行了行为测试。在大理石埋藏试验中，雄性脆弱杆菌处理的小鼠埋藏了明显更多的大理石(图4A)。考虑到这一发现可能预示着重复行为的增加，我们对重复行为进行了额外的测试，计算了在开阔场地上梳理毛发所花费的时间。与对照小鼠相比，用脆弱芽孢杆菌处理的雄性小鼠花在梳理毛发上的时间明显更多(图4B)。雄性小鼠在旷野中心花费的时间(图4C)或在旷野中行走的总距离(图4D)没有差异，这是衡量焦虑的指标。在女性中，两组在所有四项测试中都没有观察到差异(图4E-H)。因此，重复的行为是由脆弱芽孢杆菌以性别依赖的方式调节的。

图4 用脆弱芽孢杆菌治疗的雄性小鼠成年期重复行为的失调。

5.脆弱芽孢杆菌处理的雄性小鼠表现出不受控制的社会新奇行为

接下来，我们在三箱社交测试中测试了脆弱杆菌管理对表现的影响。在社交能力测试中，与空房间相比，未经处理和处理的动物对闻一只新老鼠的偏好是相同的(图5A)。然而，在社会新颖性测试中，与未处理的雄性相比，处理过脆弱杆菌的雄性显示出较少的与新动物互动的偏好(图5B)。在女性中，治疗组和未治疗组都表现出正常的社交能力和社交新奇行为(图5C，D)。总而言之，与未接受治疗的雄性相比，接受脆弱双歧杆菌治疗的雄性表现出更多的重复行为，而不是更喜欢社交新奇事物。

图5 用脆弱芽孢杆菌处理的雄性小鼠表现出不受控制的社会新奇行为

6.脆弱芽孢杆菌处理小鼠成年雄性前额叶皮质的全转录组分析

考虑到在成年后代中存在行为变化，我们接下来测试新生儿脆弱芽孢杆菌治疗是否影响成年后的皮质基因转录。取成年雄性小鼠的前额叶皮质，用RNA-seq方法进行基因表达分析。没有基因在FDR＜0.1的阈值下通过差异表达测试(图6A)。我们使用基因集浓缩分析(GSEA)进一步探索了这些数据，它可以发现与基因表达数据集中上调或下调更多的基因相关的基因生物学途径。我们发现，在脆弱芽孢杆菌组中增加的基因中，与胆固醇生物合成增加相关的基因显著丰富(图6B)，而调节神经脊分化的基因则下调(图6C)。当将我们的数据与在特定细胞类型中发现的基因数据库进行比较时，我们发现抑制性中间神经元(图6D)和抑制性神经元前体(图6E)中表达的基因显著下调。这些发现表明，脆弱芽孢杆菌在关键发育阶段的过度繁殖可以在网络水平上对皮质基因表达产生长期影响，但不会在特定基因水平上产生影响。

图6 脆弱芽孢杆菌处理小鼠成年雄性前额叶皮质的全转录组分析。

结论

总结全文，我们发现一次性治疗患有脆弱芽孢杆菌的新生小鼠会诱导类似ASD的行为。我们研究之间的不同发现可能是由于脆弱芽孢杆菌在发育和成年期的不同影响。在我们的研究中，脆弱杆菌在治疗后在小鼠身上定植了长达两周，但在八周时不再存在；然而，行为和分子表型仍然存在，这表明脆弱杆菌可以影响大脑的正常发育。目前的研究补充了最近的证据，即在ASD患者的队列中发现了类杆菌的增加，并表明它可能在神经发育调节中发挥作用。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA219 社交行为箱

社会交互行为测试（也叫3-Chambered Social Test）是常用的用于评估自闭症行为的实验。动物交际实验系统设计是在小鼠熟悉了环境后，检测小鼠靠近位于实验箱中装有另一只陌生小鼠的金属笼的时间，来判断小鼠的社交能力。在实验中，通常会比较小鼠靠近关有熟悉小鼠的金属笼时间与陌生小鼠金属笼的时间，来判断动物的社交能力。