嵌合抗原受体自然杀伤细胞疗法在实体瘤中的研究进展

摘要

作为肿瘤免疫治疗的新兴策略，嵌合抗原受体自然杀伤细胞(CAR-NK)疗法在实体瘤治疗中展现出独特优势。与嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)相比，CAR-NK具有天然抗肿瘤活性、多重杀伤机制、更佳安全性及广泛细胞来源等特点。目前全球已有30余项临床试验探索CAR-NK在实体瘤中的应用，靶向NKG2D、ROBO1等多靶点的研究取得初步成效。然而，实体瘤微环境的免疫抑制特性、NK细胞浸润不足及持久性差仍是主要挑战。CAR-NK联合治疗策略，特别是与放射治疗协同应用，显示出增强疗效的潜力。未来需通过优化CAR设计、开发新型联合方案来克服当前实体瘤治疗局限，为实体瘤患者提供更有效的治疗选择。

正文

细胞疗法是将修饰的免疫细胞转移回患者体内，以达到治疗肿瘤的目的。目前，该疗法在血液恶性肿瘤中取得巨大成功，但在实体恶性肿瘤的研究中仍处于早期阶段[1-2]。当前嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞疗法在白血病、骨髓瘤和非霍奇金B细胞淋巴瘤等血液恶性肿瘤治疗中显示出良好疗效[3]，但在实体瘤治疗中受限[4]，其原因包括实体瘤的抗原异质性与免疫逃逸[5-6]，肿瘤物理屏障的阻隔[7-9]，以及肿瘤微环境的免疫抑制作用[5]。CAR-自然杀伤(natural killer cells，NK)细胞疗法是一种新兴的免疫细胞治疗技术，它将CAR修饰到NK细胞上，使其能更精准、高效地识别和杀伤肿瘤细胞，近年来在肿瘤治疗领域备受关注[10]。

笔者在本文概述CAR-NK细胞疗法特点，综述其治疗实体瘤现状、在实体瘤治疗中的研究进展及面临的挑战，展望了CAR-NK细胞疗法应用前景。

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CA-NK细胞识别和杀伤癌细胞的机制

NK细胞是缺乏特异性抗原识别受体的先天免疫细胞，在抗肿瘤和病毒感染中起关键作用[11]。它们可通过不同途径参与免疫监视，杀死具有不同靶识别机制的癌细胞[12]。NK细胞不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制，来源多样，包括NK-92细胞、脐带血(umbilical cord blood，UCB)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)[13]。NK细胞活性受其表面活化受体(killer-cell activating receptor，KAR)和抑制受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR)调节。在正常生理条件下，NK细胞上的抑制性受体与正常细胞上的主要组织相容性复合物I类分子(major histocompatibility complex class I molecules，MHC-I)结合传递抑制信号使NK细胞失活，从而防止杀伤正常细胞。然而，在肿瘤发生或感染过程中，肿瘤和感染细胞中MHC-I表达的下调破坏了抑制信号，活化的NK细胞分泌细胞毒性蛋白穿孔素和颗粒酶，诱导癌细胞坏死和凋亡[14]。与T细胞的激活机制不同，NK细胞功能调控依赖于细胞表面激活信号和抑制信号的动态平衡[15]。这种独特的调控方式使NK细胞无需肿瘤细胞预先激活即可启动抗肿瘤免疫应答。

CAR疗法是近年来新兴的肿瘤免疫治疗方法，利用基因工程将人免疫细胞转化为能够识别和消除肿瘤细胞的CAR细胞[16]。在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞往往下调相关表面抗原或上调抑制性受体以逃避免疫监视[17]。在免疫细胞上安装CAR结构可使其识别特异性抗原; CAR与靶抗原结合时，激活信号释放细胞毒性物质[13]。目前，CAR结构已发展到第4代，在第3代(共刺激信号增强型)基础上，整合了细胞因子[如白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)]或共刺激配体[如4-1BB配体(4-1BB ligand，4-1BBL)]，通过局部免疫调节增强抗肿瘤活性，同时改善肿瘤微环境，提升持久性与疗效[18-19]。由于CAR-NK细胞治疗的特点，它在克服实体瘤异质性方面比CAR-T细胞治疗显示出潜力。

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CAR-NK细胞疗法的优势

NK细胞通过动态整合表面激活受体[如自然杀伤细胞群2D(natural killer group2D，NKG2D)、自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors，NCRs)]与抑制受体(如KIR家族、CD94/NKG2A)信号，实现对正常组织“MHC-I自身肽”的识别，从而避免对健康细胞的攻击。这种非MHC限制性识别大幅降低了“脱靶毒性”风险[20]。CAR-NK细胞活化后主要分泌干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等Th1型因子，而CAR-T细胞则高释放IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等促炎因子。这种差异使CAR-NK治疗的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)发生率降低>50%，免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)风险极低[12]。同时，由于CAR-NK细胞在体内存活周期较短(2~4周)且缺乏TCR介导的持续活化，其诱发移植物抗宿主病的概率不足5%。这一特性使其成为“现货型”(off-the-shelf)免疫治疗的理想载体，无需严格的HLA配型[21]。

CAR-NK细胞的通用性体现在细胞来源可及性与多重抗肿瘤机制的协同: 可从外周血单核细胞获取初始NK细胞; 利用单份脐带血经细胞因子(IL-2/IL-15/IL-21)或人工抗原呈递细胞刺激实现扩增; 而诱导多能干细胞技术可建立无限增殖的标准化细胞库，解决治疗级细胞规模化生产的难题[13]。CAR-NK展现出独特的双重杀伤模式: 一方面通过单链抗体介导CAR依赖性途径精准靶向肿瘤相关抗原(如CD19、BC-MA); 另一方面充分保留并强化固有免疫途径———包括释放穿孔素/颗粒酶B直接裂解靶细胞、表达FcγRIII(CD16)介导抗体依赖性细胞毒性、激活FasL/TRAIL死亡受体通路诱导肿瘤凋亡，并分泌CCL3/CCL4/CCL5等趋化因子募集T/B细胞增强适应性免疫应答[22]。此外，在靶抗原下调或缺失的情况下，CAR-NK细胞能通过NKG2D、NKp30/NKp44/NKp46等天然细胞毒性受体识别肿瘤细胞应激配体[如MHC I类链相关蛋白A/B(MHC class I chain-related protein A/B，MICA/MICB)]，有效清除MHC-I分子缺失的恶性细胞，这种“双保险”机制为克服实体瘤抗原异质性提供了解决思路[23-24]。

此外，CAR-NK细胞疗法在治疗实体瘤方面拥有巨大潜力。其通过共表达趋化因子受体C-X-C基序趋化因子受体4/2(C-X-C motif chemokine receptor4/2，CX-CR4/CXCR2)增强向肿瘤灶的定向迁移能力，并分泌基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase2/9，MMP2/9)及肝素酶降解细胞外基质屏障，提升肿瘤微环境穿透效率[23-24]; 同时针对性重塑免疫抑制性肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)—转导显性负性转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)受体Ⅱ阻断抑制信号以维持细胞毒性[25]，构建嵌合共刺激转换受体将PD-L1抑制信号转化为自然杀伤细胞群2D-4-1BB(natural killer group2D-4-1BB，NKG2D-4-1BB)激活信号[26]，并表达IL-15/21抵抗调节性T细胞(Treg)抑制作用。临床前研究证实，靶向双唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside，GD2)、黏蛋白1(mucin1，MUC1))、表皮生长因子受体变异体Ⅲ(epidermal growth factor re-ceptor variantⅢ，EGFRvⅢ)等抗原的CAR-NK细胞在胶质瘤等实体瘤模型中能抑制肿瘤生长并延长生存期，为实体瘤免疫治疗开辟新路径[27]。

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CAR-NK细胞疗法在实体瘤中的临床进展

在临床转化方面，CAR-NK疗法已取得重要进展。一项针对CD19阳性B细胞淋巴瘤的I/Ⅱ期临床试验证实，CD19-CAR-NK细胞具有显著的抗肿瘤效果[28]。目前多项临床试验正在积极推进，以系统评估其疗效和安全性。全球范围内已有30余项相关临床试验注册开展，主要集中在中国和美国。中国研究团队主导了多项创新性研究，包括靶向NKG2D(NCT03415100、NCT06478459)、ROBO1(NCT03940820)和多靶点(Clau-din6/GPC3/间皮素/AXL，NCT05410717)的CAR-NK细胞疗法，其中NKG2D CAR-NK治疗转移性实体瘤的Ⅰ期试验已入组患者30例。美国研究则聚焦于TROP2(NCT06066424)和PD-L1(NCT04847466)等靶点，其中PD-L1CAR-NK治疗胃癌/头颈癌的Ⅱ期研究正在招募患者55例。值得注意的是，MUC-1特异性CAR-NK治疗复发性实体瘤的临床试验(NCT02839954)显示，在8例可评估患者中7例达到疾病稳定且未出现严重不良事件[29]，初步证实了该疗法的安全性和潜在疗效。然而，部分试验如针对晚期肝癌的SZ003CAR-NK研究(NCT05845502)因故终止，提示该领域仍需克服肿瘤微环境抑制、细胞持久性等技术瓶颈。随着临床研究的深入，正在中国开展的200例多靶点CAR-NK大型临床试验(NCT05410717)，有望为实体瘤患者提供新的治疗选择(表1)。

与单一疗法相比，CAR-NK细胞免疫疗法联合其他治疗方法在肿瘤治疗中取得显著成果[32]。放射治疗(放疗)与NK细胞抗肿瘤免疫的协同机制主要体现在3个关键层面。在分子调控方面，放疗通过诱导肿瘤细胞DNA损伤，激活环状GMP-AMP合成酶/干扰素基因刺激蛋白(cyclic GMP-AMP synthase/stimulator of interferon genes，cGAS/STING)通路并促进I型干扰素分泌，刺激CXCL9/10/11等趋化因子的产生[33-34]。这些趋化分子通过NK细胞表面的CXCR3等受体引导其向肿瘤部位定向迁移[35]。在血管重塑方面，放疗呈现出剂量依赖性效应: 中等剂量(如10Gy)可促进一氧化氮(nitric oxide，NO)介导的血管正常化，改善肿瘤灌注和氧合; 而分次放疗(20Gy/10次)则能在维持血管密度的同时提升血管成熟度[36-37]。这种血管重构为NK细胞浸润创造了有利的微环境。临床转化证据显示，放疗可显著增加宫颈癌、子宫内膜癌和结直肠癌患者的肿瘤浸润NK细胞数量，并上调其迁移和细胞毒性相关基因表达[38]。在动物模型中，放疗联合NK细胞治疗能显著抑制三阴性乳腺癌和肉瘤的转移进展[39-40]。上述发现为放疗联合CAR-NK治疗提供了科学依据。

内抗肿瘤活性增强[41]CAR-NK-92细胞与PD-L1抗体组合在体外及体。在鼻咽癌患者异种移植物的人源化小鼠模型[42]中，免疫检查点抑制剂与造血干细胞衍生的CAR-NK组合疗法显示协同抗肿瘤应答。此外，CAR-NK细胞疗法在与化疗联合使用时可能表现出协同效应，这种组合治疗可增强CAR-NK细胞在TME中的募集和浸润[43]。

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CAR-NK细胞疗法在实体瘤治疗中面临的挑战

临床研究已初步证实CAR-NK细胞的治疗潜力。然而，其在实体瘤中的应用仍面临挑战[44]。

实体瘤TME的免疫抑制特性构成关键治疗屏障。异常的肿瘤血管结构(如内皮黏附分子低表达、血管层级紊乱)阻碍CAR-NK细胞向肿瘤核心的浸润，而缺氧/酸中毒微环境直接抑制其细胞毒性、IFN-γ分泌及活化受体[45-46]。TME中免疫抑制因子(TGF-β、PGE-2、腺苷、sMICA)与抑制性细胞[Tregs、髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MD-SCs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)]形成协同网络: 下调NK细胞活化受体并抑制ILC1分化[46]; MDSCs释放一氧化氮破坏抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)效应[47]; Tregs通过膜结合TGF-β及IL-10分泌进一步削弱NK细胞功能[30]，导致浸润的NK细胞多呈功能失调表型[48]。

细胞存活时间短限制治疗持久性。CAR-NK细胞在体内半衰期通常不足10d[49]，其短暂抗肿瘤活性在实体瘤中尤为显著[50]。离体扩增的细胞因冷冻保存敏感性需严格冷链运输[51]，而TME持续抑制作用(如缺氧诱导凋亡、抑制性信号耗竭)进一步缩短了其活性持续时间。基因工程改造(如uAPC扩增技术)虽可提升代谢适应性与抗肿瘤功能[52]，但仍未解决体内持久性不足的根本问题。

规模化制备面临多重技术瓶颈。临床级CAR-NK生产需克服三大难点。①细胞来源限制，原代NK细胞(PBMC/脐带血)起始数量有限，iPSC分化体系仍存在分化效率波动; ②高效扩增工艺挑战，需依赖人工抗原呈递细胞(aAPC)或细胞因子组合实现>1000倍扩增，但长期培养易诱发耗竭表型; ③冻存与复苏损失，解冻后细胞活性下降(通常<80%)及功能损伤增加质控成本。

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展望

CAR-NK细胞疗法代表了肿瘤免疫治疗领域的重要突破，为实体瘤治疗开辟了新路径。在可及性层面，建立诱导多能干细胞衍生的标准化细胞库，实现规模化制备; 通过自动化生物反应系统将生产周期缩短至14d，降低生产成本。新型细胞冻存技术提升资源匮乏地区的可及性。在治疗增效层面，采用双特异性抗体增强靶向杀伤效率，联合表达趋化因子的溶瘤病毒重塑肿瘤微环境; 应用表观遗传调节剂提高肿瘤抗原可见性; 结合磁共振引导聚焦超声技术协同低剂量放疗增强免疫应答。在技术优化层面，采用基因编辑技术敲除关键抑制性受体，构建微环境响应型CAR结构以动态调控细胞活性; 基于人工智能算法整合多组学数据预测疗效，通过生物标志物实时监测调整治疗方案。

目前全球范围内已有30余项临床试验正在探索CAR-NK在各类实体瘤中的应用，初步结果展现出良好的安全性和潜在疗效。CAR-NK细胞疗法联合免疫检查点抑制剂、常规化疗、局部放疗和溶瘤病毒也为患者带来新希望。未来突破方向在于贯通“技术研发-临床验证-个体化应用”，通过持续优化CAR设计、开发新型联合方案(表观遗传药物/双抗)、建立生物标志物指导的精准输注模型，实现从“泛用型”治疗向个体化策略的跃迁。

参考文献

详见

《医药导报》 2026年3月 第45卷第3期

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