FSHW | 脱脂山核桃粕水解物对D-半乳糖致小鼠记忆障碍的影响

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Introduction

在衡量个体健康和生活质量方面，衰老和记忆障碍是两个关键因素。衰老是一个不可避免的过程，会导致某些器官，特别是大脑的退化。D-半乳糖（D-gal）是一种还原糖，研究表明它可以在短时间内建立一种安全的啮齿动物衰老模型。该模型表现出与人类自然衰老相似的行为、神经和生化缺陷。因此，D-gal可用于筛选针对神经退行性疾病（包括记忆障碍）的抗衰老药物。食物来源的肽可用于日常膳食补充剂以促进健康。这些肽具有食用安全、来源方便、生产过程简单和强大的功能活性等特点。本研究旨在调查DHM水解产物（DHMH）的抗氧化能力，并评估DHMH补充剂对D-gal诱导的小鼠记忆障碍中行为、神经炎症和氧化应激效应的潜在保护作用。为深入了解坚果蛋白酶水解产物增强记忆的机制，本研究还探讨了DHMH对神经元和突触的神经保护作用。

Results and Discussion

山核桃粕酶解多肽的分子量分布

如表1所示，山核桃粕酶解产物的分子量主要低于3 kDa，占总蛋白成分的约97.22%。蛋白酶的作用促进了嵌入蛋白质基质中的生物活性肽的释放。此前报道，分子量低于3 kDa的肽相比于较大分子量的肽，表现出更高的抗氧化活性和其他有益的生理效应。这种增强的功效可能归因于较小分子与自由基结合的亲和力更高，从而减轻了这些自由基引起的过氧化作用。这些结果表明，碱性蛋白酶能有效将山核桃蛋白分解为小分子肽或游离氨基酸，所得水解产物表现出显著的抗氧化特性。

表1 脱脂山核桃粕水解产物的分子量分布

氨基酸组成测定

测得的水解氨基酸、游离氨基酸和额外氨基酸的水平分别为（2107.97 ± 760.03）、（775.56 ± 27.87）和1332.41 µg/g。值得注意的是，山核桃粕酶解产物的谷氨酸和酪氨酸含量最高，分别为（133.59 ± 3.09）和（130.08 ± 8.23）µg/g，详见表2。谷氨酸是哺乳动物大脑中最丰富的氨基酸，作为兴奋性神经递质发挥作用。此外，它在脑能量代谢、GABA和谷胱甘肽合成以及氨清除中起着关键作用。谷氨酰胺由谷氨酸和氨结合形成，可以穿过血脑屏障。在大脑中，谷氨酰胺合成酶（GS）负责大部分内源性谷氨酰胺的产生。Chen等人进行的一项研究表明，向两种阿尔茨海默病动物模型补充谷氨酰胺，可导致与脑功能障碍相关的各种生化标志物减少。具体而言，观察到炎症引起的神经元细胞周期激活、tau磷酸化和ATM激活减少。这些结果表明，谷氨酰胺补充剂可能在缓解阿尔茨海默病相关功能障碍方面具有潜在益处，并提示DHMH中同样富含的氨基酸可以穿过血脑屏障，有助于增强记忆。

表2 脱脂山核桃粕水解产物的氨基酸组成和含量

DHMH的体外抗氧化活性

PPH是一种以氮为中心的相对稳定且全面的方法，用于快速评估物质的抗氧化活性。如图1a所示，DHMH、DHM和GSH的DPPH自由基清除活性按DHMH＞DHM＞GSH的顺序增加。这些发现突出了DHMH在清除自由基方面的卓越功效，使其成为一种有前景的天然抗氧化剂。此外，DHMH对DPPH自由基表现出显著的清除能力。

氢供体和断链化合物的抗氧化活性可通过常规ABTS自由基测试有效评估，这是一种评估这些化合物的宝贵方法。如图1b所示，观察到明显的剂量效应关系，随着浓度在特定范围内增加，有毒ABTS肽的清除率也随之增加。值得注意的是，在0.4 mg/mL浓度下，DHMH对ABTS的清除效果超过GSH 40%以上，并且是DHM的两倍。

电子转移能力可通过羟基自由基中和的速度以及还原能力来证明，两者都可作为抗氧化功效的指标。山核桃粕酶解产物的抗氧化潜力通过电子转移和氢转移评估得到有效证明。值得注意的是，DHMH表现出最强的自由基清除能力，其次是DHM。在相同浓度范围内，谷胱甘肽的抗氧化能力显著优于其他两种化学物质。

图1 DHMH的体外抗氧化活性

DHMH对脑功能的影响

DHMH对小鼠体质量增加和器官指数的影响

根据饲喂期间记录的小鼠体质量和解剖过程中记录的器官重量，计算了表3中的实验结果。结果显示，模型组小鼠的体质量变化显著低于对照组（P＜0.001）。这表明D-gal对小鼠体质量增加具有一定的抑制作用。然而，与对照组相比，口服DHMH治疗的小鼠体质量变化无显著差异（P＞0.05）。此外，在器官指数测量方面，口服DHMH治疗的小鼠肝脏、肾脏和脾脏器官指数与对照组相比也无显著差异（P＞0.05）。这表明口服DHMH对小鼠器官无显著影响。综合体质量变化和器官指数的结果推断，DHMH是一种安全产品，副作用极小。

表3 小鼠体质量变化量和器官指数

DHMH对MWM中空间记忆的影响

水迷宫测试结果显示，D-gal治疗组小鼠的潜伏期显著延长（（58.27 ± 5.48）s），比对照组（（12.18 ± 4.52）s）延长了46.01 s（P＜0.001），如图2a所示。此外，水中的总游泳距离显著增加（P＜0.001，图2b），表明D-gal每日腹腔注射加速了衰老并严重损害了学习和记忆能力。这些发现证实了衰老模型的成功建立。与模型组相比，服用山核桃粕水解产物的小鼠成功找到平台的频率增加。特别是，DHMH-H组的逃逸潜伏期显著减少（（35.13 ± 17.18）s），下降了37.9%（P＜0.001）。在DHMH-H组中，到平台的总距离从（917 ± 161）mm显著缩短到（525 ± 172）mm（P＜0.01）。这些结果表明，山核桃粕水解产物可以减缓小鼠的衰老过程，并增强其在水迷宫任务中的学习和记忆能力。

图2 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠（a）逃逸潜伏期、（b）总游泳距离的影响，以及（c）第5天MWM测试中的轨迹

空间探测测试

图3展示了小鼠空间探索测试结果，揭示治疗组小鼠（（12.28 ± 7.42）%）在目标象限中的活动时间百分比显著低于对照组小鼠（（28.52 ± 14.90）%）（P＜0.001，图3a），导致在目标象限中花费的时间百分比比对照组减少了16.24%。相比之下，DHMH-H组小鼠在目标象限中的停留时间延长（（34.57 ± 11.67）%），比D-gal治疗组增加了22.3%（P＜0.001）。空间探索和位置导航测试的结果一致，支持DHMH能增强小鼠记忆的观点，且高剂量下效果更显著。MWM测试结果表明，D-gal治疗组小鼠的学习和记忆能力与对照组相比显著下降。这与之前报道的D-gal长期治疗对小鼠学习和记忆功能产生不利影响的研究一致。重要的是，DHMH减轻了D-gal对学习和记忆能力的有害影响。

图3 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠（a）目标象限百分比和（b）第5天MWM测试中的轨迹的影响

DHMH抑制D-gal诱导的小鼠Aβ1-42积累

衰老过程通过破坏对Aβ代谢至关重要的内体/溶酶体转运途径，干扰了驱动蛋白和动力蛋白之间的相互作用，导致Aβ的细胞内积累。这种破坏主要受氧化应激和神经炎症等因素的影响。此外，Aβ1-42现在被认为是细胞外淀粉样变性的主要成分，并与神经元内的病变有关。作为Aβ的一种常见亚型，Aβ1-42具有强毒性和易于聚集的特点，可触发Aβ斑块沉积、神经毒性、突触损伤和神经元死亡，从而导致AD的发生。根据图4所示数据，模型组和对照组小鼠海马体中Aβ1-42含量存在显著差异（P＜0.001）。模型组Aβ1-42含量最高（10.00 ng/mL），比对照组增加了37.9%，进一步验证了模型的成功构建。经口服山核桃残渣酶解产物治疗后，Aβ1-42水平有一定程度的下降。至于口服山核桃残渣酶解产物组，Aβ1-42含量分别达到9.26、8.83和8.31 ng/mL。特别是，DHMH-H组与模型组之间存在显著差异（P＜0.01），表明高剂量山核桃残渣酶解产物在预防Aβ1-42蛋白聚集方面具有显著作用。

图4 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠大脑中Aβ1-42水平的影响

DHMH对氧化应激的影响

与衰老相关的认知能力下降与氧化应激的影响密切相关。因此，研究了DHMH对D-gal诱导小鼠氧化还原失衡的影响。作为脂质过氧化的生物标志物，模型组血清中的MDA浓度显著升高（（15.35 ± 2.72）nmol/mL，图5a）。同时，细胞抗氧化系统主要成分GSH、GSH-PX和SOD的水平同步下降（分别为（4.38 ± 0.21）mg GSH/L、（1224.73 ± 29.48）U/mL和（306.60 ± 40.48）U/mL）（图5b-d）。这与之前的研究结果一致，即认知缺陷小鼠大脑中SOD和GSH-PX活性降低，MDA水平升高。然而，高剂量DHMH补充剂有效缓解了D-gal诱导的MDA升高以及GSH、GSH-PX和SOD水平的降低（分别为（9.78 ± 1.73）nmol/mL、（4.97 ± 0.27）mg GSH/L、（1303.35 ± 20.31）U/mL和（409.39 ± 33.4）U/mL）（图5）。SOD活性和MDA含量分别反映了小鼠的抗氧化能力和神经元损伤程度。抗氧化能力越强，对细胞的保护作用越大，间接反映了对小鼠学习和记忆的影响。同样，据报道，海参肽治疗后，小鼠血清SOD活性升高，MDA水平下降，小鼠在脑行为测试中表现良好。结合本研究结果，DHMH有效缓解了D-gal诱导的氧化应激，显示出其作为预防措施的潜力。

图5 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠血清中（a）MDA和（b）GSH水平，（c）GSH-PX和（d）SOD活性的影响

DHMH对神经炎症因子的影响

衰老引起的认知障碍中，代表性的炎症标志物包括IL-1β、IL-6和TNF-α，突出了神经炎症在此过程中的重要作用。更多证据表明，炎症是Aβ神经毒性和AD的主要原因之一。与对照组相比，D-gal诱导大脑中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著增加（分别为（259.56 ± 10.18）、（279.13 ± 45.54）和（1196.77 ± 57.89）pg/mL）（图6），而高剂量DHMH给药显著逆转了这些变化（分别为（193.56 ± 35.67）、（180.71 ± 28.46）和（934.60 ± 57.25）pg/mL）（图6）。这些结果表明，DHMH补充剂降低了D-gal诱导的小鼠海马体和皮层中的神经炎症。实验证据表明，DHMH可能潜在地改善D-gal诱导的衰老效应。

图6 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠大脑中（a）IL-1β、（b）IL-6和（c）TNF-α水平的影响

DHMH对海马神经元的影响

许多脑部疾病是由大脑皮层和海马体的神经元和突触缺陷引起的。在对照组中，海马体CA1区的神经元（图7a）呈现出组织良好、细胞结构完整、细胞核和细胞质清晰的排列。然而，D-gal给药导致海马体CA1区（图7b）的排列紊乱和松散。然而，在高剂量山核桃粕酶解产物灌胃后，观察到海马体CA1区病变得到缓解（图7c）。一项研究表明，记忆丧失与海马锥体细胞破坏和核萎缩有关。海马体CA1区特别参与空间定向相关训练特异性记忆。基于行为实验、生化指标和对小鼠海马体的H&E观察，DHMH无疑有效缓解了D-gal诱导的海马细胞损伤，从而尽可能维持细胞活力和完整性，并提高小鼠记忆能力。

图7 DHMH饲喂对D-gal处理小鼠海马神经元的影响

DHMH对D-gal诱导的突触结构损伤的影响

PSD-95是一种支架蛋白，维持突触连接并影响突触可塑性。PSD-95表达下降可能导致突触功能障碍和学习记忆能力下降。神经发育过程中的突触功能障碍与神经系统疾病的发生密切相关。D-gal暴露对小鼠海马体的突触结构有害，导致突触后密度下降。

通过Western blotting（WB）和免疫组织化学分析，确定了DHMH干预对小鼠脑组织中PSD-95表达的影响。图8a表示PSD-95的WB结果。WB结果显示，与对照组（（87.36 ± 4.52）%）相比，模型组海马体中PSD-95的相对表达（（59.05 ± 6.61）%）下降了28.31%（图8b）。有趣的是，高剂量DHMH有效增加了记忆障碍小鼠海马体中突触功能蛋白PSD-95的相对含量（（102.34 ± 6.62）%）（图8b）。

在免疫组织化学中，PSD-95阳性细胞以颗粒状形式呈棕色（图8c），在D-gal治疗组（0.00360 ± 0.00184）中的平均密度显著低于对照组（0.05070 ± 0.00934）（图8d），表明D-gal可以抑制PSD-95蛋白的表达。DHMH干预后，PSD-95染色的平均密度显著增加（0.02390 ± 0.00591）（图8d）。这些结果表明，DHMH饮食可以有效纠正D-gal引起的损伤并恢复突触功能。

图8 DHMH对D-gal诱导小鼠突触结构损伤的影响

Conclusion

本研究调查了D-gal诱导的小鼠衰老模型中DHMH的神经保护作用。DHMH通过酶解脱脂山核桃粕制备，具有强大的抗氧化和自由基清除特性。在D-gal诱导的记忆障碍小鼠模型中，DHMH显著改善了记忆缺陷。MWM测试显示，DHMH治疗小鼠的学习和记忆效果增强，表现为逃逸潜伏期和总游泳距离的缩短。此外，DHMH还提高了抗氧化酶活性，减少了D-gal引起的氧化损伤，并同时缓解了Aβ1-42的积累和炎症细胞因子，这些都与阿尔茨海默病有关。免疫组织化学检查表明，DHMH促进了海马神经元的再生，而蛋白分析揭示了海马中PSD-95表达降低的预防作用是其潜在的作用机制。总体而言，DHMH在缓解认知障碍方面显示出前景，并有可能进一步开发用于针对认知功能障碍的营养保健品。

Defatted hickory meal hydrolysate’s impact on memory impairment induced by D-galactose in mice

Fanping Qin1, Ruiling Liu1, Qi Kong1, Hangjun Chen, Xiangjun Fang, Huizhi Chen, Weijie Wu*, Haiyan Gao*

State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Key Laboratory of Intelligent Food Logistic and Processing, Key Laboratory of Post-Harvest Fruit Processing, Key Laboratory of Post-Harvest Vegetable Preservation and Processing (Co-Construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Light Industry Fruit and Vegetable Preservation and Processing, Institute of Food Science, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Defatted hickory meal (DHM), a by-product of hickory oil production, is a protein source rich in essential amino acids. In this study, the functional properties of DHM hydrolysate (DHMH) were assessed using in vitro and in vivo assays in context to its antioxidant and memory-enhancing effects. To induce memory impairment, D-galactose (D-gal) was administered to mice at a dose of 120 mg/kg body weight per day, and DHMH was orally administered at doses of 300, 600, and 1000 mg/kg body weight per day for 8 weeks. DHMH treatment led to improved memory performance in D-gal-induced memory-impaired mice, as observed in the Morris water maze test. Furthermore, DHMH mitigated the accumulation of amyloid β1-42 triggered by D-gal exposure. Notably, high-dose DHMH significantly reduced the elevation of pro-inflammatory markers, including tumor necrosis factor alpha, interleukin 1β, and interleukin 6. Additionally, DHMH prevented the decline in total superoxide dismutase activity, glutathione peroxidase activity, and glutathione levels, while reducing malondialdehyde content in D-gal-induced mice, indicative of its antioxidant properties. Moreover, DHMH treatment effectively prevented histological alterations in neurons within the hippocampal CA1 area induced by D-gal. Collectively, our findings suggest that DHMH may counteract memory dysfunctions resulting from oxidative stress injury in the brain, positioning it as a potential candidate for use as a functional food.

Reference:

QIN F P, LIU R L, KONG Q, et al. Defatted hickory meal hydrolysate’s impact on memory impairment induced by D-galactose in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250195. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250195.

翻译： 管勤昊 （实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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