JACS│基于结合能力与光物理性质正�...

来源：市场资讯

（来源：张崇敬课题组）

大家好，今天分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“Precision Design of Fluorogenic Probes via Orthogonal Tuning of Binding and Photophysics for Isoform-Selective ALDH2 Imaging ”，通讯作者是浙江大学药学院王怡教授，南洋理工大学化学与生物医学工程学院、新加坡科技设计大学的刘晓刚教授，及浙江大学药学院李欣教授。

背景介绍

荧光探针已成为可视化酶活性不可或缺的工具，具有高时空分辨率。探针通过将生化事件转化为荧光信号，能够对生命系统中酶的功能进行无创、实时监测。这一特性对于研究动态生物学过程、识别疾病生物标志物以及筛选候选治疗药物而言，是一项关键优势。但传统的荧光生成探针设计面临诸多挑战。核心困境在于如何兼顾酶的选择性与信号灵敏度：许多酶的底物特异性极强，严重限制了可用于探针修饰的化学空间。若为增强信号而引入大体积荧光团，往往会破坏酶对底物的识别或催化过程，导致探针活性丧失。与此同时，氧化、还原或异构化等酶促反应通常仅会引发微弱的光物理变化，进而导致荧光信号变化不明显。这些限制因素制约了荧光探针的应用范围与检测性能，尤其对于催化速率低、底物耐受性差或仅发生细微化学转化的酶而言，问题更为突出。

乙醛脱氢酶 2（ALDH2）是这类极具挑战性研究靶点的典型代表。作为一种负责解毒活性醛类的线粒体酶，ALDH2 在保护细胞免受氧化损伤、维持氧化还原稳态中发挥着关键作用。由基因多态性或翻译后修饰引发的 ALDH2 功能障碍，与心血管疾病、神经退行性疾病等多种病理状态密切相关。然而，ALDH2 的活性位点仅能容纳小分子醛类，且催化的结构变化极小（将醛转化为羧酸），使其难以适配荧光生成探针的设计。现有探针要么无法特异性结合该酶，要么产生的信号变化不足以实现可靠检测，在复杂生物样本中这一问题尤为突出。例如，经典的 Aldefluor（BODIPY - 氨基乙醛）与 TBA2 探针对多种 ALDH 同工酶均不具有选择性。ALDeSense 探针仅能选择性靶向 ALDH1A1，而非 ALDH2，其荧光响应幅度仅约 20 倍（Figure 1A）。因此，开发高特异性、高灵敏度的 ALDH2 探针，将为疾病诊断、药物研发和氧化还原生物学研究提供强有力的工具。

Figure 1. Precision design of fluorogenic probes for ALDH2 via orthogonal tuning of binding and photophysics.

为克服这些局限性，作者提出了一种精准的探针设计策略，该策略可解耦酶的选择性与信号灵敏度这双重限制（传统设计中酶的选择性与信号灵敏度往往不可兼得，而该策略能让这两个指标同时优化、互不冲突）。作者的方法整合了以下三个关键组成部分：（1）分子对接：通过评估探针与酶的互补性，确保探针对靶点的高结合亲和力和同工酶的选择性；（2）量子化学计算：通过模拟酶促转化过程中的相关光物理机制，预测探针的荧光增强效果；（3）结构微调：在保持探针生物相容性的同时，最大化信号放大效果。通过分别优化探针的选择性与灵敏度，该框架即便在酶的催化周转速率本就很低的情况下，也能实现稳定的信号生成。

作为概念验证，作者应用该策略开发了探针 A5— 一种对 ALDH2 具有高度选择性的荧光底物（Figure 1B）。得益于其精心设计的光物理特性，探针 A5 实现了卓越的荧光增益，能够在组织匀浆、活细胞到小鼠大脑等多种生物尺度上直观观察 ALDH2 的活性。除了探针 A5 的开发，本研究还建立了一套可推广的方法学，用于针对具有挑战性的酶靶点设计高性能荧光探针。这一策略为精准化学生物学开辟了新路径，实现了健康与疾病状态下酶功能的定量成像。

结果与讨论

（1）分子对接指导的筛选优化 ALDH2 选择性

以 ALDH2 为研究代表，作者将小分子醛基直接或通过 π 共轭连接臂与一系列电子特性各异的荧光团相连，构建了醛基-荧光团偶联物的虚拟文库。值得注意的是，所选荧光团不仅易于合成，还是生物成像研究中常用的生物相容性骨架，确保其在后续应用中具有良好的细胞膜通透性和低细胞毒性。

作者将这些偶联物对接至人源 ALDH2 的活性位点（蛋白质数据库编号：3INJ），并优化打分函数，以同时评估探针与酶的结合亲和力和活性位点互补性。研究中特别注意使醛基部分朝向催化性半胱氨酸（Cys302），同时最大限度减少连接的荧光团产生的空间位阻。多个候选化合物展现出良好的酶相容性（Figure 2A）。

Figure 2. Screening for selective ALDH2 substrates via docking.

为评估同工酶选择性，作者将排名靠前的化合物与相关的 ALDH 同工酶（如 ALDH1A1、ALDH3A1）进行交叉筛选，优先剔除对多种同工酶存在非特异性结合的化合物，最终得到一组预测对 ALDH2 具有高特异性的候选化合物（Figure 2B）。其中，化合物 128 成为极具潜力的骨架结构：它包含一个萘环荧光团和一个丙烯醛衍生的醛基。分子对接分析显示，该化合物的醛基可与 Cys302 形成共价加合物，同时芳香环与 Phe170 发生 π-π 相互作用。不过，该荧光团的远端区域缺乏稳定的相互作用，这提示可通过取代对其进行进一步优化，以增强结合稳定性并微调光物理特性。

（2）基于量子化学的分子内电荷转移扭曲（TICT）荧光增益评估。

为实现稳定的信号放大，作者接下来聚焦于优化探针候选物的光物理响应（Figure 3）。具体而言，作者探究了扭曲分子内电荷转移（TICT）机制是否可用于提升底物态与产物态之间的荧光对比度。TICT 是供体-受体型荧光团中一种公认的非辐射淬灭途径：在激发态下，电荷分离会促使供体和受体形成扭曲的近垂直构象(Figure 3A)。这种构象会使振子强度大幅降低至接近零，从而使荧光团几乎无荧光发射。关键是TICT 的形成对取代基的电子性质高度敏感：醛基（-CHO）等强吸电子基团会促进 TICT 的形成，而羧酸根（-COO⁻，生理条件下羧酸的去质子化形式）等弱吸电子基团则倾向于抑制 TICT 的形成。这些基团的吸电子能力可通过其电子亲和能量化，电子亲和能数值越正，代表吸电子特性越强。重要的是，即使连接有 π 桥，这种吸电子能力的趋势（-CHO > -COO⁻）依然成立（Figure 3B）。这种可切换的光物理特性，使 TICT 机制特别适用于检测醛基氧化这类细微的酶促修饰过程。

Figure 3. Twisted intramolecular charge transfer (TICT) modulation in ALDH2 imaging probes.

作者推测，ALDH2 催化的醛基（-CHO）向羧酸根（-COO⁻）的转化，会减弱 TICT 效应并恢复荧光发射，从而实现显著的荧光开启响应。为验证这一推测，作者对 8 种极具潜力的 ALDH2 结合候选化合物进行了量子化学计算(Figure 2A)。结果显示，化合物 18、31 和 33 在氧化前后，基态均为预扭曲构象，这意味着其激发态构象弛豫程度大，荧光响应有限；化合物 29 和 133 缺乏 π 桥，TICT 行为在氧化前后几乎无变化。与之相反，化合物 30、128 和 134 在醛基形式下具有显著的 TICT 倾向，而转化为羧酸根后，TICT 倾向被抑制(Figure 3,Figures S4, S5)，表明这些化合物具有很高的荧光激活潜力。

基于良好的对接结果和显著的光物理开关特性，作者选择化合物 128 进行深入研究。为探究其激发态行为，作者将供体-受体二面角 θ 从 0°（平面构象）旋转至 90°（扭曲构象），构建了 S₁激发态势能面，模拟探针从具有荧光发射的局域激发态（LE）向无荧光发射的 TICT 态的转变(Figure 3C )。对于 128-CHO（醛基形式），其势能面显示，分子可克服可忽略的能垒（0.01 eV）弛豫为扭曲构象，证实其具有强烈的 TICT 倾向，也说明未反应的底物探针几乎无荧光发射。相反，128-COO⁻（羧酸根形式）的分子扭曲需要克服显著的能垒，更易形成平面的荧光发射构象(Figure 3D )。这些结果证实，酶促氧化不仅改变了探针的化学结构，还调控了其激发态动力学，从而显著提高荧光量子产率。

（3）结构微调与实验验证确定 A5 为最优ALDH2 探针

为了验证量子化学模型预测的基于 TICT 机制的信号增强效果，作者合成了一系列含醛基的探针（A1~A8）及其对应的羧酸根产物（C1~C8）(Figure 3E, 4A )。这些衍生物通过修饰化合物 128 供体基团的远端区域得到，引入了不同的取代基以调控电荷转移强度、光谱性质和 TICT 行为。其中，A 系列探针保留了可被酶促氧化的活性醛基，C 系列探针则模拟了氧化后的羧酸根产物。

Figure 4. Characterizing probe A5 for detecting ALDH2 activity.

作者首先测定了 A 系列和 C 系列化合物的荧光量子产率(Figure 4A)。结果与预期一致：含有氨基、羟基或甲氧基等强供体基团，并与醛基受体配对的 A 系列探针，荧光量子产率接近零，与高效的 TICT 形成相符；而缺乏强供体基团的探针（如 A2）则表现出较高的背景荧光，这证实了供体-受体的极化作用对激活 TICT 机制的必要性。

经酶促氧化后，醛基向羧酸根的转化显著降低了受体的吸电子能力，导致 TICT 效应被抑制，所有 C 系列产物均表现出强烈的荧光发射（量子产率 > 0.10）。这些结果证实，TICT 调控能使这类探针的荧光增益显著提升。量子化学建模对 A5 和 C5 的分析结果与上述发现一致：A5 可克服可忽略的能垒（0.04 eV），快速发生构象旋转形成 TICT 态；而 C5 则更倾向于形成平面的分子内电荷转移（ICT）构象，TICT 态的稳定性显著降低，这一变化可归因于强吸电子的醛基向弱吸电子的羧酸根的转化。

随后，作者在重组 ALDH2 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸正离子（NAD⁺，2.5 mM）存在的条件下，评估了 A1~A8 的酶学性质。如Figure 4A结果显示，所有探针的米氏常数（Kₘ）均在 0.35~1.44 μM 之间，与天然底物乙醛的 Kₘ（约 1.8 μM）相近，证实探针与酶的结合亲和力未受明显影响。但受荧光团部分的空间位阻和电子效应限制，这些探针的催化常数（Kcat）降低了 5~20 倍，这是基于活性的探针设计中一种可预见的权衡结果。

尽管催化常数只是适中，但在 ALDH2 的作用下，多款探针因 TICT 机制的有效调控，表现出强烈的荧光开启效应。其中，A5 的荧光增强效果最为显著（Figure 4B），相较于先导探针 A1 提升了 20%。尽管 A5 的供体基团强度略弱于化合物 128（或 A1，Figure 3E），但其优异的性能可能源于更高的催化效率（Kcat/Kₘ=0.14 S⁻¹・μM⁻¹），几乎是 A1 催化效率（0.07 S⁻¹・μM⁻¹）的两倍，这表明A5 在酶相容性和产物荧光亮度之间实现了最优平衡。这些数据充分证明，A5 在酶学和光学层面均得到了有效优化。

为阐释探针信号增益的差异原因，作者计算了各探针的催化效率（Kcat/Kₘ）与对应 C 系列产物光物理亮度（Φ・ε，Φ 为荧光量子产率，ε 为激发波长下的摩尔消光系数）的乘积。如Figure 4C结果显示，探针的灵敏度与该综合指标呈高度正相关，这确立了一个通用规律：荧光输出与酶催化效率和荧光增益的乘积成正比。这一关系进一步验证了我们模块化设计框架的预测能力。

作者随后对 A5 进行了详细的表征，以评估其稳定性和特异性。全发射光谱证实，经 ALDH2 处理后，A5 的荧光信号随其自身浓度和 ALDH2 浓度的增加而呈依赖性升高（Figure 4D, 4E），这证明该探针用于定量检测。液相色谱-质谱（LC-MS）分析证实，A5 可在酶的作用下转化为 C5 （Figure 4F），验证了该探针的酶促反应路径。A5 在多种生物相关活性物质存在的条件下，仍表现出优异的化学稳定性（Figure 4G），且对伯胺无反应性不会被酯酶、蛋白酶等非靶标酶激活（Figure 4H）。重要的是，同工酶筛选结果显示，A5 仅能被 ALDH2 特异性催化，其催化速率相较于其他 ALDH 家族成员高出 7~30 倍，验证了基于分子对接的选择性设计的有效性（Figure 4I）。

这些研究结果表明，A5 是文库中的最优探针，兼具三大特性：（1）高酶结合亲和力（微摩尔级低 Kₘ值）；（2）稳定的荧光响应（转化后具有高 Φ・ε 值）；（3）优异的化学和酶学选择性。上述结果证实，分子对接指导的结合作用优化、基于 TICT 的光物理调控和结构微调的协同应用取得了成功，也使 A5 成为生物系统中 ALDH2 亚型选择性成像的高性能探针。

（4）组织匀浆中 ALDH2 活性的定量检测

为评估 A5 的高荧光响应是否能转化为优异的检测性能，作者以乙醛氧化生成 NADH 的传统分光光度法为参照，对 A5 检测法的灵敏度进行了标定。两种检测方法均在相同的微孔板平台上进行，且缓冲液和温度条件保持一致。以纯化的产物 C5 为校准标准，作者确定了 A5 检测法的检测限（LOD）为 1.3 nM，较 NADH 检测法的检测限（2.8 μM）低 3 个数量级。若以催化常数（Kcat）归一化以反映实际检测灵敏度（即单位时间内可检测的最低酶活性），A5 检测法的灵敏度较传统方法提升了约 240 倍(Figure 5A)。

Figure 5. Imaging ALDH2 activity in multiscale systems.

随后作者将 A5 检测法应用于小鼠肝、脑、心脏和外周血的组织匀浆，检测其中的 ALDH2 活性（Figure 5B）。结果显示，在所有检测的组织中，A5 的荧光信号均随时间呈依赖性升高，可实现酶活性的动力学定量分析。值得注意的是，A5 是唯一能检测出血液样本中 ALDH2 活性的方法，而 NADH 检测法在血液样本中无法产生可检测的信号（Figure 5C, 5D）。在各组织中，肝脏的 ALDH2 活性最高，其次是大脑，心脏和血液中的活性较低，这一趋势与已知的 ALDH2 组织分布特征一致，验证了基于 A5 的检测结果的生物学真实性。与之相反，NADH 检测法的动态范围更窄，样本间的变异性更高，在脑和心脏组织中尤为明显，这限制了其在酶丰度低的样本中的应用。

为评估 A5 在生物相关模型中检测 ALDH2 活性波动的能力，作者在大鼠中开展了慢性酒精暴露实验（n=4）。实验中，大鼠每日被给予乙醇，持续 15 天。利用 A5 检测法，在第 1 天和第 15 天的急性乙醇刺激前后，追踪外周血中的 ALDH2 活性。该实验方案可对同一动物的 ALDH2 活性进行时间分辨记录，最大限度降低个体间的变异性。结果显示，慢性酒精暴露后，大鼠外周血中 ALDH2 的基线活性升高，这与解毒通路的代偿性上调一致；但慢性暴露会加速急性酒精刺激后 ALDH2 活性的下降，表明酶对氧化还原胁迫的敏感性增强。这些观察结果与以往报道的氧化胁迫条件下 ALDH2 的氧化失活现象相符，凸显了 A5 在微创样本中对酶活性进行纵向追踪的应用价值。

综上，A5 为复杂生物基质中 ALDH2 活性的定量检测，提供了一个高灵敏度、多功能的平台。该探针能够检测低丰度样本中的酶活性、区分不同组织中的酶活性差异，并报告酶活性对生理刺激的动态响应，展现出传统检测方法无法企及的性能。这些优势使 A5 成为研究 ALDH2 功能机制，以及疾病诊断、药物反应监测等转化应用的有力工具。

（5）活细胞和活体小鼠中 ALDH2 活性的成像

为评估 A5 在活细胞成像中的应用价值，作者在小鼠小胶质细胞系 BV2 中测试了其性能。结果显示，加入 A5（10 μM）后，细胞内的荧光信号随时间呈依赖性升高，并在约 30 分钟后达到平台期，且荧光信号随 A5 浓度的增加而升高。据此，作者确定了该模型中可靠检测荧光信号的最优成像条件：A5 浓度 10 μM，孵育时间 30 分钟。

为证实荧光响应源于酶的催化活性，而非非特异性相互作用，作者先将 BV2 细胞与 ALDH2 的已知激活剂 Alda-1 或不可逆抑制剂双硫仑（DSF）预处理，再用 A5 染色。结果显示，Alda-1 处理使细胞荧光呈剂量依赖性升高，而 DSF 则显著抑制荧光信号（Figure 5E），证实 A5 可在完整细胞中特异性报告 ALDH2 的活性。在肝癌细胞系 HepG2、神经细胞系 SH-SY5Y 等其他细胞类型中，也观察到了类似的趋势。值得注意的是，HepG2 细胞的荧光响应最强，与该细胞内源性 ALDH2 高表达的特征一致。这些数据验证了 A5 是一种细胞膜通透性的、基于活性的探针，可在多种细胞体系中对 ALDH2 进行定量、亚型选择性的成像。

基于 A5 在细胞水平的优异表现，作者进一步利用双光子荧光显微镜，测试了其在活体小鼠中成像 ALDH2 活性的能力。实验中，小鼠每日被给予不同浓度的乙醇（体积分数 10%、20%、40%；11 mL/kg/ 天），持续 7 天，以调控体内 ALDH2 的活性。在第 8 天对小鼠大脑皮层进行成像（Figure 5F）。实验中同时注射磺基罗丹明 101（SR101）作为星形胶质细胞的特异性标记物。

结果显示，小鼠大脑中的 A5 荧光信号随乙醇暴露剂量的增加呈依赖性升高（Figure 5G 5H），这与外周血中观察到的 ALDH2 活性代偿性上调一致。重要的是，A5 的荧光信号与 SR101 无共定位，表明 ALDH2 的活性主要定位于非星形胶质细胞群中，这与以往的研究发现一致 —— 星形胶质细胞中并不富集 ALDH2，其更典型的谱系标记物为 ALDH1L1。

这些结果首次实现了细胞分辨率下 ALDH2 活性的在体成像，揭示了活体大脑中 ALDH2 活性的动态调控特征。这些发现凸显了 A5 的独特优势：实时信号生成、亚型特异性、亚细胞分辨率，以及与深层组织成像技术的兼容性，展现出传统生化检测方法和非选择性荧光探针无法实现的应用能力。

（6）ALDH2 激活剂的发现与治疗验证

基于 A5 的高灵敏度、亚型选择性和与活细胞检测的兼容性，作者建立了一种双平台筛选策略，将完整细胞中的高内涵荧光成像与纯化 ALDH2 的体外酶学检测相结合，用于筛选 ALDH2 激活剂。

作者首先开展了虚拟筛选，筛选出 68 种预测可结合 ALDH2 的候选小分子。随后，利用两种正交方法对这些化合物进行评估：（1）基于 A5 的活细胞成像检测；（2）传统的乙醛- NADH 酶学检测（Figure 6A）。两种平台筛选出的阳性化合物各有不同：基于细胞的筛选更倾向于筛选出膜通透性好、细胞内活性高的化合物，而体外酶学检测则能检测出直接的酶调节剂（包括膜通透性有限的化合物）。重要的是，两种平台筛选结果的交集，确定了一组高可信度的阳性化合物，用于后续验证。

Figure 6. ALDH2 activator screening and validation.

最终，3 种化合物（Comp 11、Comp 48、Comp 57）从交集中脱颖而出，且 A5 成像实验证实，这些化合物可增强细胞内的 ALDH2 活性。进一步的表征显示，这些化合物可剂量依赖性地与 ALDH2 结合，并激活乙醛的转化反应：Comp 48 和 Comp 57 的半数有效浓度（EC₅₀）处于低微摩尔范围，而 Comp 11 尽管活性稍弱，但能诱导最强的最大响应（Figure 6B，6C）。

为评估这些化合物的治疗价值，作者在 APP/PS1 转基因小鼠（一种广泛应用的阿尔茨海默病（AD）模型）中，对 Comp 11 和 Comp 48 进行了测试，并将已知的 ALDH2 激活剂 Alda-1 作为参照。结果显示，所有化合物在体内均具有良好的耐受性。行为学实验表明，在旷场实验和高架十字迷宫实验中，Comp 11 可显著改善小鼠的焦虑样行为，而 Comp 48 和 Alda-1 则无此效果(Figure 6D−G)。在嗅觉辨别实验中，Comp 11 和 Alda-1 可改善小鼠的寻食行为，表明其能部分逆转小鼠的感觉损伤。在新物体位移实验和莫里斯水迷宫实验等空间记忆评估中，与未处理的 AD 小鼠相比，3 种化合物均能改善小鼠的记忆能力(Figure 6H, 6I)。以上数据表明 Comp 11 具有广泛的神经保护作用。

为评估这些化合物的生化功效，作者检测了小鼠前额叶皮层（PFC）中的 ALDH2 活性 —— 前额叶皮层是认知功能的关键脑区，也是 AD 病变的主要受累区域。基于 A5 的检测结果显示，AD 小鼠的前额叶皮层中 ALDH2 活性显著降低，而 Comp 11、Comp 48 或 Alda-1 处理可恢复该酶的活性。与之相反，NADH 检测法仅在以 ALDH2 表达水平归一化后，才能检测到酶活性的恢复，而以总蛋白含量归一化时，则无法分辨酶活性的变化(Figure S30)，这进一步凸显了 A5 检测法的高灵敏度。

以上研究结果表明，A5 是一个可靠的平台，可用于激活剂的发现和功能验证，覆盖从高通量筛选到体内疗效评估的全流程。Comp 11 和 Comp 48 成为极具潜力的候选化合物，在 AD 模型中展现出分子层面和行为层面的修复效果。尽管这些化合物的体内药代动力学特征（生物利用度、代谢、组织分布）尚未明确，且其对 β 淀粉样蛋白（Aβ）负荷、炎症标志物、氧化应激等关键生化终点的影响仍需检测，但本研究为开发具有治疗潜力的 ALDH2 靶向药物，提供了新的先导化合物，值得开展进一步的详细药理学和机制研究。

结论

本文作者开发并验证了一种精准设计框架，该框架系统性地解决了为具有挑战性的酶靶点设计荧光探针的难题。作者将选择性和灵敏度的优化解耦，并将该方法成功应用于 ALDH2 探针 A5 的开发 — 与传统检测方法相比，A5 对 ALDH2 具有极高的特异性，灵敏度提升约 240 倍。作者利用 A5 在从血液到脑组织的复杂生物环境中，实现了 ALDH2 活性的实时成像，证实了该设计框架的实际应用价值；同时，该探针助力在阿尔茨海默病临床前模型中，发现了具有治疗功效的新型酶激活剂。最终，本研究建立了一种合理、可推广的方法学，用于开发高性能的基于活性的探针。该策略为推进酶成像技术、加速药物筛选进程，以及开展各类具有挑战性的生物系统的机制研究，提供了强有力的手段。

文献整理：Linhao

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c13638