原代细胞培养失败？可能是内毒素捣乱

细胞莫名死亡、转染效率低至30%、同样的protocol却做不出同样的结果——遇到这些情况，你的第一反应是什么？

细胞状态不好？血清批次有问题？转染试剂不给力？

很少有人会想到是内毒素在“捣乱”吧？它隐藏在细胞培养基、添加物、质粒中，难以被发现，却悄无声息地吞噬着实验数据和结果。内毒素可能从一开始就在那里，只是你从来没测过。

一

内毒素对细胞培养的多方位伤害

内毒素会造成细胞形态发生明显变化，如体积缩小、折光率降低等，还抑制细胞的增殖。内毒素在敏感细胞中诱导caspase-3介导的凋亡通路，使原代细胞存活率骤降。其磷酸基团能与细胞膜上的蛋白质反应，或其脂肪酸链与脂质膜和蛋白质亲水区发生作用，改变细胞膜形态，导致细胞功能障碍。

LIU等人通过MTT法测定了脂多糖（LPS，内毒素的主要成分）对H292和THP-1细胞的毒性作用。结果发现，与未处理的对照组相比，低浓度（1-2.5 μg/mL） LPS处理后，细胞活力未观察到显著变化，表明此浓度下的LPS对细胞无毒性。而高浓度（5-20 μg/mL）的LPS对H292和THP-1细胞具有显著的细胞毒性。

LPS刺激对H292与THP-1细胞活力的影响（源自文献：DOI: 10.3892/mmr.2018.8542）

Schwarz H等人发现0.02-2 ng/mL的内毒素（LPS）能激活细胞的免疫反应，且不同细胞对内毒素的敏感度不一样。如THP-1细胞在受到最高浓度LPS（2 ng/mL）刺激时，仅IL-8表达量显著增加，而在相同浓度下，moDCs会大量分泌IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α。人单核细胞和CD1c+ DCs对内毒素更敏感，0.2 ng/mL的LPS能够诱导所有细胞因子释放。

低浓度LPS对不同人类免疫细胞细胞因子产生的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

因此，在细胞培养实验中，内毒素影响细胞的生理状态和功能，降低实验的可靠性和可重复性，此外，内毒素的存在可能影响细胞因子和蛋白质的表达控制，细胞信号通路、蛋白质相互作用等研究需要注意内毒素的干扰。对于细胞衍生产品（如疫苗、免疫细胞治疗等）更应关注内毒素污染。

二

重组蛋白内毒素对细胞培养的影响

重组细胞因子在细胞培养和扩增分化过程中具有重要作用。免疫学实验、细胞凋亡实验、干细胞培养与分化、类器官模型构建等，都需要使用低水平内毒素的细胞因子。细胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平内毒素的重组蛋白是获取可靠实验结果的基础。

为评估重组蛋白中内毒素对细胞的免疫反应，Schwarz H等人构建了对LPS高度敏感的HEK293细胞。将这些细胞分别暴露于不同浓度的重组蛋白（来自两个不同的供应商）和LPS中。结果显示，供应商1的重组蛋白可使NF-kB表达量升高，而供应商2的重组蛋白则未激活NF-kB表达。供应商1重组蛋白诱导NF-kB表达的效果与0.02 ng/mL LPS相近，说明重组蛋白中少量内毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng蛋白）足以激活NF-κB通路。

内毒素对HEK293细胞中NF-kB激活的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

三

细胞培养过程中如何避免内毒素污染？

义翘神州给出了全新的解决方案，采用先进的技术工艺和设备生产ProPure™超低内毒素蛋白，内毒素水平低至0.05 EU/mg，部分产品甚至达到0.01 EU/mg，达到行业标准的10倍以上，为细胞培养提供更可靠的选择。

义翘神州位于德克萨斯州的生物工程中心（C4B）采用先进的技术和设备生产ProPure™超低内毒素蛋白，内毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），显著优于行业标准（USP <85>：0.5 EU/mg），适用于临床前动物研究、严格的细胞实验与高敏检测分析。同时，C4B还提供超低内毒素蛋白定制服务，满足临床前和药物开发中对内毒素控制的更高标准需求。

四

义翘神州如何将内毒素控制到极致？

义翘神州在蛋白生产过程中通过以下工艺升级，确保蛋白的超低内毒素水平：

源头预防：从质粒构建到缓冲液配制，我们采用严格的质量控制体系，使用无内毒素质粒和缓冲液、低内毒素吸附塑料容器，并遵循常规在位清洗（CIP）原则。

环境隔离：我们的美国生物工程中心（C4B）在设计之初就确立了“零大肠杆菌”的原则，不使用大肠杆菌表达系统，且不引入任何大肠杆菌或内毒素，从物理空间上彻底切断污染路径。

双重检测：我们采用LAL（鲎试剂法）和rFc（重组C因子法）方法检测内毒素浓度，严格监控内毒素水平，确保每一批次数据可追溯、可信赖。

基于这套严密的“预防-隔离-检测”三重控制体系，义翘神州能够将内毒素风险降至检测限值，为药物开发和临床前研究提供定制化的超低内毒素蛋白产品和服务，满足严苛的质量要求。

值此重磅产品上市之际，义翘神州推出多项重磅活动：

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超低内毒素蛋白产品列表（部分热门靶点）

参考文献：

Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

Xuefang Liu, et al. LPS-induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542