Advanced Science | 单细胞和空间转录组揭示玉米响应南方玉米锈病侵染的细胞类型特异性免疫调控网络

近年来，单细胞转录组和空间转录组技术的突破为植物与病原物互作研究带来了前所未有的精度提升：前者能够在单个细胞水平上解析基因表达，揭示植物应答病原侵染时的细胞异质性；后者则能够绘制基因在组织内的空间表达图谱，追踪特定位置和时间下的转录动态。两者的整合为解析植物免疫的分子机制提供了全新视角，直观地揭示了不同细胞类型和组织区域如何协同应对外界胁迫。由多堆柄锈菌（Puccinia polysora, P. p）侵染引起的玉米南方锈病，是威胁全球玉米生产的重要病害，严重时可导致减产50%以上。病原菌通过玉米叶片表面侵入，在植株系统性扩展，破坏光合作用，影响籽粒灌浆。尽管已有多个南方锈病基因被鉴定，但玉米如何在不同细胞类型和组织层面协调免疫响应，一直是尚未解析的关键问题。

近日，河南省农业科学院粮食作物研究所曹言勇团队联合河南农业大学植物保护学院施艳团队、中国农业科学院作物科学研究所段灿星团队在Advanced Science期刊在线发表题为“Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal Cell-Type- Specific Immune Regulatory Networks in Maize Responding to Southern Corn Rust”的研究论文， 该研究整合单细胞核转录组和空间转录组技术，构建了玉米应答南方锈病侵染早期的高分辨率时空转录图谱。首次系统描绘了8种主要叶片细胞类型在病原菌侵染过程中的转录动态，揭示了表皮细胞和叶肉细胞在早期免疫中的核心作用，并明确了不同细胞类型在免疫响应中的功能分工。并挖掘出了ZmXET1和ZmRBG为玉米防御南方锈病的关键基因，为抗病育种提供了有价值的靶点。

1. P. p在玉米幼苗叶片中的侵染建立

通过系统的时间进程分析，明确了P. p在抗病玉米自交系齐319叶片中的早期侵染动态。接种后24小时，P. p已完成初始侵染并形成气孔下囊，但叶片表面无可见症状；接种后48小时菌丝扩展并形成吸器，接种后72小时侵染进一步推进但症状仍不显现，直至10天后才出现典型病斑和孢子堆。结合组织学观察与真菌生物量定量，研究将24和48小时确定为侵染早期的关键时间点——此时真菌已建立侵染而寄主防御反应尚未全面启动，为后续解析玉米对南方锈病的早期响应机制提供了重要的时间窗口（图1）。

图1. 玉米叶片中P. p的侵染过程

2. P. p侵染玉米叶片的细胞类型鉴定

利用单核和空间转录组技术，研究团队构建了P. p侵染24和48小时后玉米叶片的细胞类型图谱。共获得13万余个高质量单细胞核数据，经聚类分析鉴定出16个细胞簇，归并为8种主要细胞类型，包括叶肉细胞、表皮细胞、维管束鞘细胞、保卫细胞等（图2）。通过标记基因筛选和GO富集分析，明确了各细胞类型的功能特征，如叶肉细胞主要参与光合作用和防御相关代谢。结合公共数据库和RNA原位杂交实验，验证了关键标记基因的特异性表达。该高分辨率单细胞图谱为后续解析细胞类型特异性免疫响应提供了可靠的基础。

图2. 受P. p侵染的玉米叶片细胞转录组图谱

3. 基于空间转录组图谱的P. p侵染玉米叶片组织可视化分析

进一步利用空间转录组技术，实现了对P. p侵染玉米叶片过程中基因表达的空间可视化解析。通过对接种后24和48小时的叶片切片进行测序，共获得21388个有效空间位点，聚类为7个细胞簇，并成功将其定位到叶片横切面的具体解剖位置。结合标记基因验证，明确了5种主要细胞类型：表皮细胞、叶肉细胞、维管束鞘细胞、维管组织细胞和伴胞。进一步鉴定出各细胞类型的特异性标记基因。分析发现，侵染后24和48小时，表皮细胞和叶肉细胞中细胞类型特异性基因的表达量显著上升，提示这两类细胞在玉米应答病原菌侵染过程中发挥关键作用（图3）。

图3 受P. p侵染的玉米叶片空间转录组图谱

4. 免疫相关基因的细胞类型特异性差异表达

进一步系统分析了玉米叶片中免疫相关基因的细胞类型特异性表达模式。研究发现，模式识别受体相关基因（RLPs和RLKs）在侵染后24小时表现出明显的细胞类型差异：RLP基因（如Zm00001eb170180）主要在叶肉细胞中上调表达，而RLK基因则在表皮细胞和铺板细胞中显著激活。抗病基因方面，多数NL类型基因在侵染后下调，部分CNL类型基因则表现出上调趋势。进一步分析茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）信号通路相关基因发现，这两条激素通路的响应不具有明显的细胞类型特异性，而是在各细胞类型中呈现较为一致的激活模式。值得注意的是，激素通路在侵染后24小时整体被激活，但部分基因（如ZmbHLH116）的表达则延迟至48小时才显著上调。这些结果表明， 玉米叶片应答侵染时，免疫识别相关基因表现出精细的细胞类型分工，而激素信号通路则呈现时间动态的协同调控特征（图4）。

图4 免疫相关基因的细胞类型特异性差异表达

5. 共表达网络分析揭示玉米叶片响应P. p侵染的核心功能模块

通过共表达网络分析，揭示了玉米叶片应答P. p侵染过程中的空间协调防御模式。共鉴定出14个基因共表达模块，其中3个模块在侵染后24小时表现出细胞类型特异性的显著变化：维管束鞘细胞中“绿松石模块”基因显著上调，主要参与氧化胁迫响应；叶肉细胞中“黄绿色模块”被激活，富集于光合作用相关过程；而表皮细胞中“绿色模块”基因显著下调，主要涉及细胞壁生物合成。进一步鉴定出各模块的核心枢纽基因——维管束鞘中的半胱氨酸蛋白酶基因ZmCPP3、叶肉中的光捕获蛋白基因ZmLHCB7以及表皮中的糖转运蛋白基因ZmSTP19，它们在侵染早期的表达变化进一步验证了上述模块的调控方向。综合这些结果， 研究提出一个“两阶段防御重编程”模型：1）侵染后24小时，玉米叶片内部细胞（维管束鞘和叶肉）迅速激活胁迫响应和光保护通路，2）同时表皮细胞的结构合成暂时受到抑制。 这种空间上分工明确的调控策略，可能有助于植株在早期将资源集中于关键防御部位（图5）。

图5 共表达模块揭示了与玉米叶片受P. p侵染相关的关键功能模块

6. 分化轨迹与细胞注释揭示防御型叶肉细胞的重要作用

通过拟时序分析，进一步揭示了叶肉细胞在应答P. p侵染过程中的功能分化。基于基因表达特征，叶肉细胞被划分为光合型、前体型、传递型、海绵组织型和防御响应型5个功能亚群。拟时序轨迹分析显示，细胞分化路径由海绵组织叶肉细胞起始，经防御响应型叶肉细胞，最终到达叶肉传递细胞。比较侵染组与对照组发现，侵染后24小时，两组细胞分化轨迹出现明显分离，差异主要集中在海绵组织与防御响应型细胞之间；同时，防御响应型叶肉细胞的比例在24小时显著上升，至48小时差异减弱。对该亚群的基因功能分析表明，其高表达基因主要参与胁迫应答、脱落酸信号通路和活性氧响应等过程。其中，细胞分裂素诱导蛋白酶基因ZmCIP1在侵染后24小时的叶肉细胞中显著上调，空间转录组数据进一步验证了这一表达特征（图6）。这些结果表明，防御响应型叶肉细胞是玉米早期免疫的重要组成部分，在病原菌侵染后被迅速招募并执行特定的防御任务。

图6 叶肉细胞响应P. p侵染的分化轨迹

7. 分化细胞间通讯揭示P. p从表皮细胞到叶肉细胞的侵染过程

通过细胞间通讯分析，揭示了玉米叶片应答侵染过程中不同细胞类型之间的协同配合。分析表明，表皮细胞、叶肉细胞和维管束鞘细胞之间存在广泛的基因互作网络（图7）。聚焦于表皮与叶肉细胞，研究发现多个配体-受体对在侵染后被激活。例如，表皮细胞中的热休克蛋白基因ZmHSP90与叶肉细胞中的细胞壁相关激酶基因ZmWAK2存在特异性互作；另一个HSP90家族成员与叶肉细胞中一个未知功能基因的互作对，则仅在侵染后的玉米叶片中检测到，表现出病原菌诱导的细胞类型特异性（图7）。进一步整合空间转录组数据发现，表皮细胞中的谷胱甘肽转移酶基因ZmGST3与叶肉细胞中的Zm00001eb061210这一互作对，在单核和空间两个数据集中均被稳定检出，且两个基因在侵染后24和48小时均保持高表达水平。这些结果从 分子互作层面证实，表皮细胞与叶肉细胞在病原菌侵染过程中存在活跃的“对话”，这种细胞间的协同响应是玉米构建有效免疫的重要环节（图7）。

图 7 细胞间通讯揭示从表皮细胞到叶肉细胞的信号传导过程

8. 玉米抵御P. p侵染关键基因的鉴定

通过整合单核和空间转录组数据，系统鉴定了玉米应答侵染的关键调控基因。差异表达分析显示，侵染后24小时是转录响应最活跃的时期，叶肉细胞、表皮细胞和维管束鞘细胞中大量基因表达发生变化，而保卫细胞中差异基因数量较少；至48小时，各细胞类型的转录响应普遍减弱（图8）。功能富集分析表明，侵染早期各细胞类型普遍激活蛋白质加工与稳定相关通路，而后期主要富集茉莉酸信号和脂质氧化等过程。进一步聚焦于叶肉和表皮细胞，研究在两个时间点共有的差异表达基因中筛选出5个核心基因。其中，4个基因（ZmEUL、ZmRBG、ZmLOX4、Zm00001eb165310）在侵染后上调表达，而木葡聚糖内转糖苷酶基因ZmXET1则显著下调（图8）。单细胞和空间数据均验证了这些基因的表达变化趋势。为验证这些基因的功能，研究采用病毒诱导的基因沉默技术对ZmXET1和ZmRBG进行了表型分析。沉默ZmXET1后，植株接种病原菌后症状明显减轻，真菌生物量减少，细胞损伤程度降低；而沉默ZmRBG则导致病害加重，真菌增殖更旺盛，细胞结构破坏更严重。这两个基因呈现相反的功能 方向：ZmXET1负向调控抗病性，ZmRBG则正向参与防御响应。综合以上结果，研究不仅从多组学数据中挖掘出核心候选基因，还通过功能实验验证了它们在玉米抵御过程中的作用，为后续抗病育种提供了重要靶点。

图8 参与玉米抵御P. p侵染的关键基因

综上，该研究首次构建了玉米防御南方锈病的高分辨率时空转录图谱，为理解玉米如何在不同细胞层面协调免疫响应提供了基础框架。不仅揭示了不同细胞类型在免疫中的“分工合作”，还成功鉴定并验证了两个关键基因的功能。这一发现为玉米抗病育种提供了全新的分子靶点，也为未来精准设计抗病作物奠定了重要的理论基础。

河南省农业科学院粮食作物研究所/神农种业实验室曹言勇研究员、河南农业大学植物保护学院粮食作物病虫害检测与防控创新团队施艳教授和中国农业科学院作物科学研究所段灿星研究员为共同通讯作者。河南农业大学植物保护学院粮食作物病虫害检测与防控创新团队青年教师王琼琼博士、河南省农业科学院粮食作物研究所在站博士后孙新艳副研究员、河南农业大学在站博士后孙迎超及河南省农业科学院粮食作物研究所程泽强研究员为论文共同第一作者。河南农业大学汤继华教授、李洪连教授，中国农业科学院作物科学研究所程子祥博士，河南省农业科学院博士研究生韩胜博，河南农业大学硕士研究生冯莹，河南农业大学生命科学学院青年教师吴晓林副教授、张菁华副教授，以及团队杨文博博士、朱美琛博士等多名成员也参与了此项工作的研究。本研究得到河南省重点研发计划、河南省农业科学院新兴学科专项、北京联创种业科企合作项目、中国农业科学院农业科技创新工程、河南省高校创新科研团队、河南省科学技术协会青年人才托举计划项目及河南省现代农业产业技术体系等项目联合资助。感谢中国农业科学院作物科学研究所翁建峰研究员、中国农业大学周涛教授为本项目提供的指导与帮助。

论文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202512295