Mol Cell | Restrictor通过识别序列特异性RNA介导基因外DNA的转录终止

撰文 | 格格

哺乳动物基因组中广泛存在基因间区转录现象，但基因的转录输出量远高于基因间区，提示细胞存在主动限制基因外转录的调控机制【1, 2】。近年来发现的Restrictor复合物（由WDR82和RNA结合蛋白ZC3H4组成）能够特异性终止基因间区转录，而对蛋白编码基因影响有限，其缺失会导致基因间区RNA Pol II获得异常持续合成能力，产生大量本应被抑制的lncRNA【3】。然而，Restrictor如何特异性识别并终止基因间区转录的分子机制尚不清楚：是WDR82的染色质招募决定了靶标特异性，还是ZC3H4通过RNA序列识别介导选择性终止？尽管早期在果蝇中发现ZC3H4同源蛋白Su(s)可序列特异性结合RNA基序，但该机制在哺乳动物中是否保守、以及Restrictor两个亚基如何分工实现靶标选择性，一直是领域内未解决的核心科学问题。

近日 ， 来自 意大利欧洲肿瘤研究所 的Gioacchino Natoli研究团队在Molecular Cell杂志发表题为Sequence-specific RNA recognition drives Restrictor-mediated termination of extragenic transcription的研究论文，这项研究旨在解析Restrictor复合物特异性终止基因间区转录的分子机制，发现了WDR82负责将Restrictor招募至活跃转录位点但不提供靶标特异性，而ZC3H4通过其C3H1型锌指结构域特异性识别基因间区转录本5'端富集的RNA序列基序（与果蝇中报道的基序高度相似），从而介导选择性转录终止，揭示了Restrictor通过“WDR82介导招募、ZC3H4识别RNA”的双重机制实现靶标特异性的工作原理。

首先，研究人员通过CRISPR-Cas9技术在HeLa细胞中敲除了ZC3H4蛋白的C3H1型锌指结构域和SRG结构域。他们使用超分辨率显微镜和4sU-seq技术评估了这些突变对基因 外DNA 转录的影响。结果显示，敲除C3H1锌指或SRG结构域均导致基因 外DNA 转录无法被有效抑制，表明这两个结构域在Restrictor活性中发挥重要作用。

接着，研究人员使用RNA Bind-n-Seq (RBNS) 技术研究了ZC3H4的C3H1锌指的RNA结合特异性。他们构建了一个随机RNA库，并与不同浓度的ZC3H4-C3H1蛋白混合。通过高通量测序分析发现，ZC3H4-C3H1锌指特异性地结合富含GUA重复序列的RNA片段。进一步分析表明，ZC3H4-C3H1锌指与WDR82互作的结构域并不影响其RNA结合特异性。 研究人员 进一步分析ZC3H4 RNA结合基序在基因组中的分布发现，与编码基因相比，ZC3H4 RNA结合基序在基因 外DNA 转录起始位点附近富集，特别是那些被Restrictor抑制的非编码转录本，表明ZC3H4的RNA结合活性与基因 外DNA 转录调控密切相关。

为验证ZC3H4与靶RNA的直接相互作用，研究人员使用增强型交联和免疫沉淀 (eCLIP) 技术分析了ZC3H4在HCT116细胞中的结合位点。结果显示，ZC3H4与大量非编码转录本的5'端结合，且与4sU-seq和ChIP-seq数据一致。此外，eCLIP分析还发现ZC3H4结合的RNA片段与转录抑制相关，进一步证实其RNA结合活性与转录调控功能有关。

为全面了解Restrictor的活性范围，研究人员使用DRB暂停RNA Pol II的延伸，并在DRB释放后检测ZC3H4的结合位点。结果显示，DRB释放后ZC3H4的结合位点数量和信号强度显著增加，表明Restrictor对基因 外DNA 转录的抑制具有更广泛的活性范围。

最后，通过遗传互补实验分析ZC3H4不同结构域的功能，结果显示C3H1锌指、SRG结构域和WDR82互作结构域对基因 外DNA 转录调控都至关重要。其中，WDR82互作结构域负责将Restrictor招募至转录起始位点，而C3H1锌指和SRG结构域则参与靶RNA的序列特异性识别。

图1 序列特异性RNA识别驱动Restrictor介导的基因外转录终止

总之， 该研究发现ZC3H4的C3H1通过序列特异性RNA结合识别基因 外DNA 转录本，从而介导Restrictor对基因 外DNA 转录的选择性抑制，为理解基因调控的复杂机制提供了新的见解 。

https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(26)00101-2

制版人： 十一

参考文献

1. Almada, A.E., Wu, X., Kriz, A.J., Burge, C.B., and Sharp, P.A. (2013). Promoter directionality is controlled by U1 snRNP and polyadenylation signals.Nature499, 360–363.

2. Field, A., and Adelman, K. (2020). Evaluating Enhancer Function and Transcription.Annu. Rev. Biochem.89, 213–234.

3. Austenaa, L.M.I., Piccolo, V., Russo, M., Prosperini, E., Polletti, S., Polizzese, D., Ghisletti, S., Barozzi, I., Diaferia, G.R., and Natoli, G. (2021). A first exon termination checkpoint preferentially suppresses extragenic transcription.Nat. Struct. Mol. Biol.28, 337–346.

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