circRNA互作蛋白筛选：银染+LC-MS/MS一体化

RNA pull-down结合LC-MS/MS鉴定RNA互作蛋白：以hsa_circ_0007142为例

摘要

RNA与蛋白质相互作用是RNA功能研究的核心证据之一。RNA pull-down技术以生物素标记RNA探针为核心，通过链霉亲和素磁珠富集RNA-蛋白复合物，结合银染与LC-MS/MS鉴定得到候选互作蛋白清单。本项目以hsa_circ_0007142为目标RNA，构建含T7 promoter的正义链与反义链DNA模板，完成PCR扩增、体外转录与生物素标记、磁珠捕获、洗涤洗脱、银染与质谱鉴定流程，形成可用于后续机制验证的数据基础。

研究流程总览（模板构建→T7转录→Biotin-RNA→磁珠捕获→银染→LC-MS/MS）

1 引言

非编码RNA尤其是circRNA因其稳定性高、表达特异性强而成为研究热点。大量研究表明，circRNA可以通过与RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）形成复合物参与转录调控、RNA代谢、蛋白定位与信号通路调节。围绕特定RNA“以RNA为中心”的互作解析方法中，生物素化RNA-链霉亲和素磁珠捕获（RNA pull-down）配合蛋白质组学鉴定，是获得互作蛋白谱的经典路线。相关综述系统梳理了RNA-centric捕获策略、体外/体内方法差异以及与质谱联用的优势与局限。

RNA互作研究常用路线示意（Biotin-RNA pull-down vs BSJ-ASO pulldown）

2 材料与方法

2.1 目标RNA与模板信息

报告目标RNA为hsa_circ_0007142，来源DOCK1，长度427 nt。

表1 hsa_circ_0007142基本信息

项目

信息

基因名称

hsa_circ_0007142

来源基因

DOCK1

基因长度

427 nt

hsa_circ_0007142序列与探针设计示意（含T7 promoter模板）

2.2 含T7 promoter的正义/反义链DNA模板构建

实验目的为构建hsa_circ_0007142全长载体，并以质粒全长序列为模板PCR扩增，获得含T7 promoter序列的正义链和反义链DNA，作为体外转录制备RNA pull-down探针的模板。

表2 PCR引物序列（红色部分为T7 promoter序列）

基因名称

引物序列

0007142-Fsense

aaaaTAATACGACTCACTATAGGGCTTTTTATAACTATGATGCCAGAG

0007142-Rsense

CTGTTTCCATAATCAATTTTGG

0007142-Fantisense

CTTTTTATAACTATGATGCCAGAG

0007142-Rantisense

aaaaTAATACGACTCACTATAGGGCTGTTTCCATAATCAATTTTGG

2.3 PCR扩增、凝胶检测与胶回收

PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系如下。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（90V，30min）。DNA回收采用胶回收流程：CB2柱平衡（500 μl BL，12000 rpm离心1 min）、切胶称重、PC溶胶（50℃约10 min）、上柱吸附、PW漂洗两次、离心干燥、室温放置3 min、EB 30 μl洗脱（室温2 min，12000 rpm 1 min）。

表3 PCR反应条件

温度（℃）

时间（s）

循环数

98

10

31

55

5

72

10

表4 PCR反应体系

试剂

使用量(μl)

终浓度

PrimeSTAR Max Premix（2X）

25 μl

1X

Primer F

1 μl

0.2 μM

Primer R

1 μl

0.2 μM

Template

10 ng

灭菌水

Up to 50 μl

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

正义链/反义链PCR扩增电泳图（Sense与Antisense）

2.4 体外转录与生物素标记RNA

体外转录与生物素标记RNA步骤如下：取无RNA酶EP管加入转录体系，37℃孵育35 min；加入DNaseⅠ 2 μl，37℃孵育15 min去除DNA；加入0.2M EDTA（pH=8.0）2 μl终止反应；取3 μg Biotin标记RNA加入Structure Buffer（10 mM Tris pH=7.0，0.1 M KCl，10 mM MgCl2）进行二级结构复性（95℃ 2 min，冰浴3 min，室温30 min）。

表5 转录体系（表2-2）

组分

用量

线性化DNA片段

1 ug

Biotin RNA Labeling mix

2 µl

10× Transcription buffer

2 µl

RNA Polymerase

2 µl

RNase-free water

补足至20 µl

2.5 链霉亲和素磁珠捕获与RNA-蛋白结合反应

链霉亲和磁珠与生物素标记RNA结合：颠倒混匀磁珠并转移30 μl至新EP管；磁分离弃上清；60 μl A液重悬并磁分离；30 μl B液重悬并磁分离；30 μl C液重悬并磁分离，重复C液洗涤；加入30 μl 1×RNA Capture Buffer重悬；加入50 pmol生物素标记RNA并吹打混匀；室温旋转孵育30 min。样本前处理：1 ml 4℃ RLN悬浮细胞，冰上孵育5 min；1450×g、4℃离心2 min去上清；100 μl预冷RLN洗涤1次（不悬浮沉淀）；100 μl预冷protein lysis buffer重悬细胞，超声2 s开/4 s停×10次，涡旋30 s并吹打混匀；冰上孵育30 min；17000×g、4℃离心15 min；转移上清备用。磁珠复合物与蛋白结合：磁分离后用30 μl C液洗涤两次；加入100 μl 1×Protein-RNA Binding Buffer重悬磁珠；加入按下表配制的反应体系mix重悬磁珠；4℃旋转孵育30 min。洗涤与洗脱：磁分离弃上清；100 μl 1×wash buffer重悬磁珠并洗涤，重复两次；加入50 μl Elution buffer重悬磁珠；磁分离转移上清得到pull-down产物；加入13 μl loading buffer，沸水浴10 min；产物进入后续质谱检测。

表6 磁珠复合物与蛋白结合反应体系

序号

试剂

体积（ul）

1

10X Protein-RNA Binding Buffer

10

2

50% glycerol

30

3

细胞裂解液

30

4

Nuclease-free water

30

3 结果

3.1 银染结果

RNA pull-down产物进行银染，获得条带图用于展示捕获蛋白的整体富集情况。

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

RNA pull-down银染结果图

3.2 LC-MS/MS质谱结果

RNA pull-down产物进行质谱鉴定。报告给出了质谱结果下载链接与提取码，作为项目数据交付的一部分。

3.3 WB结果

报告注明：WB通常用于验证“RNA是否与某个特定蛋白结合”的项目。

4 讨论

RNA pull-down结合质谱的价值在于一次性获得候选互作蛋白谱，为机制链路提供方向。公开综述指出，RNA-centric捕获与质谱联用是识别RNA结合蛋白的重要策略，并对体外探针捕获与体内捕获各自的优缺点进行了系统比较。在circRNA研究中，互作蛋白可直接构成机制核心证据。例如，circ-Foxo3与p21和CDK2形成三元复合物从而阻滞细胞周期进程的工作，被广泛引用为“circRNA-蛋白互作驱动功能”的代表性案例。在方法层面，针对circRNA的BSJ反义寡核苷酸捕获路线同样显示：围绕“特异位点（BSJ）”进行富集能显著提升内源互作解析的可靠性。因此，基于本项目获得的银染与质谱结果，可直接支撑后续的候选蛋白验证与机制闭环构建，并与RIP/CLIP、功能实验等工作形成连续的研究证据链。

参考文献

1) Tsuji Y, et al. Optimization of Biotinylated RNA or DNA Pull-Down Assays. Int J Mol Sci. 2023.

2) Jazurek M, et al. Identifying proteins that bind to specific RNAs. Nucleic Acids Res. 2016.

3) Huang A, et al. Circular RNA-protein interactions: functions, mechanisms, and identification methods. 2020.

4) Das D, et al. Antisense Oligo Pulldown of Circular RNA for Downstream Analysis. 2021.

5) Du WW, et al. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2. 2016.

技术服务优势

1. 关键实验条件记录完整：PCR条件与体系、转录体系、磁珠体积（30 μl）、RNA用量（50 pmol/3 μg）、孵育时间与离心条件等均可复现并直接写入论文方法学。

2. 银染与质谱双读出：银染展示捕获条带，LC-MS/MS输出候选互作蛋白清单，结果结构清晰。

3. 正义/反义模板体系：含T7 promoter的正义链与反义链模板齐备，互作解析中对照逻辑清楚。

4. 流程闭环交付：模板扩增、体外转录、生物素标记、磁珠捕获、洗涤洗脱、电泳银染、质谱鉴定与数据整理一次完成。

5. 结果可衔接验证：质谱候选蛋白可进一步用WB、RIP/CLIP等方法验证并形成机制闭环。