Nature | 配体特异性激活轨迹决定GPCR的信号转导

撰文|存中一贯

细胞表面受体被胞外配体激活是细胞间通讯的标志性事件，调控着人体绝大多数生理功能。G蛋白偶联受体（GPCR）是最大的膜受体家族，配体激活后，GPCR通过招募并激活细胞内的G蛋白将信号传递至细胞内部【1】。配体能以不同强度激活（激动剂）或抑制（拮抗剂）受体，这种配体激活效能的多样性是药物开发的基础【2】。然而，配体效能的内在分子本质及其在活细胞中激活GPCR的具体机制，目前还不清楚。

近年来，一些荧光光谱实验以及核磁共振（NMR）研究证实，GPCR并非作为简单的开关运作，而是在多种失活态与激活态之间保持动态平衡【3,4】。部分激动剂（Partial agonists）和完全激动剂（full agonists）所维持的GPCR-G蛋白复合物构象完全不同。有观点认为，部分激动剂稳定的GPCR-G蛋白复合物，其介导核苷酸交换的效能有所降低【5,6】。不过，所有这些研究都是在分离体系中进行的，使用了在去垢剂胶束或纳米盘中重构的纯化受体。GPCR在活细胞的生理环境中是否也会采取不同构象并形成不同的信号转导复合物，目前还不清楚。

近日，来自德国莱比锡大学的Andreas Bock团队联合Irene Coin团队在Nature杂志发表了他们最新的研究成果，题目是

Ligand-specific activation trajectories dictate GPCR signalling in cells

GPCR的激活会导致受体发生大规模的构象变化，最显著的是TM6胞内部分的向外移动，使得其能够与G蛋白偶联并激活后者。同时，G蛋白的结合也会促进受体的构象变化，包括其胞外结构域和配体结合口袋的变化，从而稳定激动剂的结合。受体胞外与胞内结构域之间的这种信息传递，体现了变构耦合的基本原理。

为了高分辨率地监测GPCR胞外表面的构象变化，研究人员计划开发一种新型的生物传感器，这种传感器应具备以下特点：具备遗传编码特性；配备尺寸最小化的标记；保持细胞内表面未修饰，以确保G蛋白偶联功能不受影响。满足上述条件的最佳方法是，利用基因编码化学锚定物，然后通过生物正交化学（bioorthogonal chemistry）方法将探针连接至活细胞中的GPCR受体上。简言之，通过遗传密码扩展技术（genetic code expansion technology, GCE）将携带锚定物的非经典氨基酸（non-canonical amino acid, ncAA, 非天然氨基酸）插入到受体的序列中。之后应用ultrarapid strain-promoted inverse electron-demand Diels-Alder cycloaddition方法对添加的非天然氨基酸进行点击化学修饰，以达到在相应氨基酸上进行标记的目的，这种方法不会对既有的功能结构域产生影响，且反应可在几分钟内完成。利用这种方法，研究人员在M2R受体的胞外区域进行了一系列的标记。经过一系列荧光检测，发现有7个位点（Thr84，Glu175，Ala414，Pro415，Phe181，Phe188，Asn419）的插入标记能够对M2R全激动剂acetylcholine（ACh）敏感。Ach处理能够明显检测到Cy3标记荧光的改变，反映了配体刺激引起的M2R胞外构象的改变。另外，变构激动剂LY2119620同样能够引起这7个位点变体的荧光改变，但M2R拮抗剂则完全不能引起荧光的改变。上述检测结果表明，这7个插入突变能够通过荧光改变来反映配体刺激引起的M2R受体胞外构象改变。

上述工具提供了一种不影响受体与胞内G蛋白结合，而检测配体激活引起的胞外构象改变的方法。利用上述工具，研究人员探究了不同配体对M2R的激活情况，使用的配体包括：全激动剂ACh，超级激动剂iperoxo，部分激动剂arecoline和pilocarpine。所有这些激动剂都能够引起前述7个生物感受器的荧光变化，且具有浓度依赖性。整体而言，配体的激活能力越强，其引起的生物感受器荧光改变程度也越大。比如，与全激动剂ACh相比，iperoxo在5个生物感受器中引起的荧光改变程度更大（M2R84，M2R175，M2R414，M2R415，M2R419），仅在M2R188中引起的荧光改变程度较小，而对M2R181则不敏感，不引起荧光改变。部分激动剂Arecoline在所有7个生物感受器中引起的荧光反应程度都比ACh小，而pilocarpine则在M2R181和M2R188中引起的荧光反应程度比ACh更显著，在其他位点都弱于ACh引起的荧光变化。

上述结果表明，激动剂激活引发的构象变化程度，在某些受体位点上与激动剂效能呈正比，而在其他位点呈反比，这一观察结果表明M2R在活细胞中呈现多种活性状态，这些状态对G蛋白信号传导的激活能力各不相同。为探究这种差异性M2R-G蛋白复合物的存在，研究人员通过增加G蛋白偶联来调控不同状态间的平衡。研究人员构建了一个G蛋白突变体GαoA(G203T)，将受体平衡推向高效价、高亲和力的M2R-G蛋白复合物状态。该Gα突变体对GDP和GTP均具有低亲和特性，其与激动剂结合受体的偶联可形成稳定的无核苷酸受体-GαoA蛋白复合物。

后续荧光实验结果显示，所有M2R生物传感器均对GαoA(G203T)过表达敏感，但响应程度强烈依赖于配体和测试的生物传感器。根据变构偶联原理，GαoA(G203T)偶联诱导的M2R构象变化应与胞外激动剂结合引发的构象变化相互映射。在G蛋白过表达条件下，这些构象变化发生在激动剂添加之前。因此，当激动剂刺激指示高效价M2R-G蛋白复合物形成的生物传感器时，会导致荧光发射强度减弱或无变化。进一步的实验显示，GαoA(G203T)过表达导致M2R175生物传感器上激动剂诱导的荧光变化完全消失，M2R415的荧光变化减少了约30-80%，说明这两个位点参与了高效能受体-G蛋白复合物的形成。而在过表达GαoA(G203T)的情况下，激动剂促进的M2R181和M2R188荧光变化增加，可能揭示了与M2R175和M2R415生物传感器响应丧失或减少所揭示的复合物不同的另一种低效能、可能结合GDP的M2R-G蛋白信号复合物。

进一步分析荧光变化动力学，结果显示高效能复合物形成较快，而低效能复合物形成较慢，不同配体在激活受体的过程中会沿着不同的轨迹形成两种复合物。ACh，iperoxo和pilocarpine激活过程中会首先形成高效能复合物（C1），其标志是175位点感受器荧光的增强，这个过程发生在200ms至1s之间。之后，低效能的C2复合物再缓慢形成，这个发生在2-5s之间。最终C1和C2复合物会同时存在，并保持比例平衡。不过，不同配体激活情况下，C1和C2形成的时间以及比例均有差异。而arecoline介导的激活与上述3个配体完全不同，它会首先形成一个高效能复合物（C3），但发生变化的生物感受器位点与之前的不同，说明其形成轨迹具有独特性。

上述结果表明，所有配体介导的M2R激活都会先后形成高效能以及低效能复合物，两种复合物同时存在，且保持平衡。每个配体的激活都具有其独特的激活轨迹。本研究通过这些数据的分析，展示了GPCR激活过程中配体依赖的受体复合物形成机制，为靶向GPCR进行的药物开发提供了坚实的理论基础。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09963-3

制版人： 十一

参考文献

1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F. & Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature 459, 356–363 (2009).

2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B. & Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 829–842 (2017).

3. Nygaard, R. et al. The dynamic process of β2-adrenergic receptor activation. Cell 152, 532–542 (2013).

4. Manglik, A. et al. Structural insights into the dynamic process of β2-adrenergic receptor signaling. Cell 161, 1101–1111 (2015).

5. Gregorio, G. G. et al. Single-molecule analysis of ligand efficacy in β2AR-G-protein activation. Nature 547, 68–73 (2017).

6. Huang, S. K. et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A2A receptor during G protein coupling. Cell. 184, 1884–1894 (2021).

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