FSHW | 一种海产品毒素软骨藻酸通过调节NRF2和NF-κB通路对视网膜的毒性

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Introduction

细胞在代谢过程中会产生自由基，同时抗氧化剂会中和这些自由基。细胞通常在抗氧化剂和自由基之间保持平衡，通过持续的代谢能量输入来维持还原环境，从而使特定酶保持还原状态。抗氧化系统失衡，由ROS过量产生引起，导致细胞无法解毒有毒条件，从而导致细胞功能障碍甚至细胞死亡。核因子红细胞2相关因子2（NRF2）是一种能够泛素化其靶底物并将底物招募到蛋白酶体的酶；它是靶向抗氧化反应最广泛研究的因子之一。NRF2被描述为细胞对氧化剂抵抗的重要调节因子，通过控制细胞氧化还原稳态并诱导几种抗氧化反应元件依赖性基因的表达来调节氧化剂暴露的生理和病理生理效应。已广泛证实，许多海洋生物毒素，包括软骨藻酸（DA），可在不同类型的细胞和组织中引起炎症。F-κB通路在调节炎症介质的表达中起主导作用。DA已被证明能激活小鼠海马体中的NF-κB通路并上调NF-κB通路相关炎症基因的表达。作者还观察到DA处理激活了人视网膜细胞中的NF-κB通路并上调了相关的炎症介质，这表明它可能导致DA诱导的视网膜毒性。本研究旨在评估软骨藻酸（DA）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞和斑马鱼胚胎的毒性作用。研究结果与早期在不同模型中证实DA毒性作用的发现一致，表明DA对人RPE细胞和斑马鱼胚胎具有毒性效应。作者发现DA呈剂量依赖性地显著降低细胞活力，诱导活性氧（ROS）过量产生，改变RPE细胞中的丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平以及过氧化氢酶（CAT）活性，降低抗氧化能力，促进炎症，并导致斑马鱼胚胎中的光感受器细胞损失。

Results and discussion

DA对RPE细胞活力的影响

DA是一种广为人知的神经毒素，可作为细胞膜中的离子型受体激活剂，干扰细胞功能，最终导致细胞肿胀和死亡。为评估DA对人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞的毒性，本研究采用MTT法检测了ARPE-19细胞在不同浓度（0、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5和10.0 µmol/L）DA暴露24 h后的细胞活力。1 µmol/L及以上浓度的DA暴露导致细胞活力显著下降。其中，5 µmol/L DA的毒性高于1.0和2.5 µmol/L，但低于7.5和10.0 µmol/L。因此，本研究选择5 µmol/L的DA浓度用于后续实验。

DA导致RPE细胞氧化应激

本研究测量了经5 µmol/L DA处理24 h的ARPE-19细胞的ROS产生情况。结果显示，处理组细胞的ROS水平比未处理细胞显著高出55.5% (P < 0.000 1)（图1A）。过氧化氢酶（CAT）利用过氧化氢作为底物将其分解，以维持细胞内分子的最佳水平，这是维持细胞功能的重要机制。与对照组相比，DA处理组的CAT活性显著降低了27% (P < 0.001)（图1A）。鉴于谷胱甘肽（GSH）在通过清除ROS或作为GSH S-转移酶和过氧化物酶的关键辅因子在视网膜细胞抗氧化稳态中发挥重要作用，作者测量了暴露于DA 24 h和未经处理细胞中的GSH水平。与未经处理的对照组相比，处理组的GSH水平显著降低了96% (P < 0.000 1)（图1A）。丙二醛（MDA）可以指示细胞膜损伤，并作为脂质过氧化的生物标志物。自由基失衡会影响MDA的产生；因此，作者定量了经5 µmol/L DA处理或未经处理24 h的ARPE-19细胞中的MDA水平。结果显示，与未经处理的对照组相比，MDA水平显著增加了37% (P < 0.001)（图1A）。

使用qRT-PCR定量了靶基因——超氧化物歧化酶1（SOD1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）的表达。结果发现，DA处理的细胞中

SOD1

SOD2

鉴于核因子红细胞2相关因子2（NRF2）调节抗氧化反应元件依赖性基因的表达，以介导与氧化剂暴露相关的生理和病理生理过程，本文调查了DA暴露是否改变了NRF2的相对表达。通过qRT-PCR测量，暴露于DA 24 h的ARPE-19细胞中

NRF2

图1 DA对人RPE细胞抗氧化能力的影响。(A) ROS产生、CAT活性、GSH和MDA水平。(B) 抗氧化基因的表达。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 3）表示。*P < 0.001；**P < 0.000 1。

图2 未处理和DA处理的ARPE-19细胞的(A) 细胞质和(B) 细胞核组分中的NRF2，通过Western blot检测，并分别通过GAPDH和HISTONE H3归一化定量。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 3）表示。P < 0.01；*P < 0.001。

DA在RPE细胞中诱导炎症

DA处理导致氧化应激，从而刺激炎症。因此，作者使用ELISA量化了经5 µmol/L DA处理或未经处理24 h的细胞培养基中分泌的促炎介质IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α。数据显示，与未经处理的细胞相比，这些细胞因子显著增加，其中IL-1β增加67.1% (P < 0.001)，IL-6增加158.2% (P < 0.000 1)，IL-8增加57.8% (P < 0.001)，TNF-α增加53.1% (P < 0.001)（图3A）。作者还通过qRT-PCR检查了相关介质基因的表达，发现IL-1β的mRNA水平增加了63.3% (P < 0.000 1)，IL-6增加了77.8% (P < 0.000 1)，IL-8增加了83.3% (P < 0.000 1)，TNF-α表达增加了83.8% (P < 0.000 1)，与未经处理的细胞相比（图3B）。

NF-κB激活诱导促炎基因的转录，并被报道为在中枢和适应性免疫细胞中发挥同时作用的核心促炎介质。该通路可在特定细胞刺激（通常与病原体或应激信号相关）下激活。本实验定量了经5 µmol/L DA处理或未经处理的ARPE-19细胞的细胞质和核组分中NF-κB复合体组分p65的水平。与未经处理的细胞相比，细胞质组分中的p65水平显著高出102% (P < 0.000 1)，核组分中增加了59.2% (P < 0.01)（图4），表明NF-κB信号通路被激活。

图3 DA暴露增加了促炎介质的表达。(A) 通过ELISA检测未处理和DA处理的ARPE-19细胞中分泌的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α。(B) 通过qRT-PCR测量未处理和DA处理的ARPE-19细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA水平的定量，并用看家基因GAPDH归一化。数据通过非参数

t

图4 未处理和DA处理的ARPE-19细胞中(A) 细胞质和(B) 细胞核组分中NF-κB p65蛋白水平，通过Western blot检测，并分别通过GAPDH和HISTONE H3归一化定量。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 3）表示。**P < 0.01，****P < 0.000 1。

DA导致RPE细胞凋亡

鉴于DA暴露降低了RPE细胞活力并导致氧化应激和炎症，作者使用TUNEL分析来检测DA是否导致细胞死亡。暴露于5 µmol/L DA 24 h的ARPE-19细胞的细胞死亡率增加了1690% (P < 0.001)，与未经处理的对照组相比（图5）。

图5 DA暴露诱导ARPE-19细胞凋亡。TUNEL检测显示处理过的细胞凋亡显著增加。(A) 未处理和DA处理条件下死亡细胞的图像。阳性对照用100 µL DNase I (10单位/mL)处理5 min，阴性对照用100 µL平衡缓冲液处理5 min。样品用TUNEL试剂（红色）染色并与DAPI（蓝色）共染以检测凋亡细胞。(B) 以300 个细胞为基数量化凋亡细胞，结果以百分比表示（（凋亡细胞数/300）× 100）。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 3）表示。***P < 0.001。

为确定DA暴露是否破坏了细胞骨架结构，用鬼笔环肽染色ARPE-19细胞，发现DA暴露的细胞丝状结构显著受损。未经处理的细胞呈现长而结构良好的丝状结构；相比之下，DA处理的细胞丝状结构缩短（图6），这表明细胞骨架的破坏可能导致DA相关的细胞凋亡。

图6 DA暴露导致ARPE-19细胞骨架损伤。与未处理的对照细胞相比，处理过的细胞骨架显著受损。细胞用鬼笔环肽染色并在共聚焦显微镜下观察以检测丝状结构，细胞核用DAPI（蓝色）标记。

DA对斑马鱼胚胎的毒性作用

为评估DA对斑马鱼胚胎的毒性，让胚胎暴露于不同浓度（0.5、1.0、2.5、5.0、7.5和10.0 µmol/L）的DA，从受精后1天（dpf）到5 dpf，并监测死亡率、孵化率、心跳率和畸形情况。经0.5、1.0或2.5 µmol/L DA处理2天后，斑马鱼胚胎的死亡率无显著差异。然而，经5.0 µmol/L DA处理2 天后，死亡率增加了22% (P < 0.05)，7.5 µmol/L DA处理增加了38% (P < 0.01)，10 µmol/L DA处理增加了72% (P < 0.000 1)。死亡率与暴露时间长短和药物浓度成正比；所有暴露于10 µmol/L DA的胚胎在处理3 天内全部死亡。在2 dpf（暴露24 h）时，暴露于5.0、7.5或10.0 µmol/L DA的胚胎孵化率分别显著降低了40% (P < 0.001)、54% (P < 0.001)和65% (P < 0.001)，与未经处理的胚胎相比（图S5）。暴露于5.0或10.0 µmol/L DA的胚胎心跳率也比对照组略微降低10.4% (P < 0.01)。还监测了形态异常，包括身体轴弯曲和心包水肿。暴露于0.5、1.0、2.5或5.0 µmol/L DA的胚胎在5 dpf之前表现出正常形态，而暴露于7.5或10.0 µmol/L DA的样品在3 dpf之前表现出异常。基于这些观察，选择5 µmol/L DA用于后续实验。

DA暴露导致斑马鱼胚胎氧化应激和炎症

从人视网膜细胞获得的体外数据表明，DA暴露导致氧化应激和炎症；因此，作者还调查了DA暴露斑马鱼胚胎中的氧化应激和炎症。与未经处理的对照组相比，DA处理的胚胎中ROS显著增加了52% (P < 0.000 1)。暴露于DA的斑马鱼胚胎的CAT活性也显著降低了23.4% (P < 0.00 1)，GSH水平显著降低了54.4% (P < 0.001)，而MDA水平显著增加了32.2% (P < 0.001)（图7A）。进一步检查了DA对某些抗氧化基因表达的影响，发现DA暴露的胚胎中sod1、sod2、cat和gpx1基因分别显著降低了23.4% (P < 0.001)、26.2% (P < 0.001)、27.1% (P < 0.000 1)和48.3% (P < 0.000 1)，与对照组相比（图7B）。

图7 DA暴露对斑马鱼胚胎氧化应激的影响。(A) DA处理的胚胎中ROS产生增加，CAT活性和GSH水平降低，MDA水平增加。(B) DA处理的胚胎中sod1、sod2、cat和gpx1表达降低，与未处理的胚胎相比。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 3）表示。P < 0.01，P < 0.001，***P < 0.000 1。

DA暴露导致斑马鱼胚胎光感受器损失

DA暴露4 天后，对斑马鱼胚胎进行切片并进行H&E染色以检查视网膜形态。与对照组相比，暴露于5 µmol/L DA的胚胎视网膜光感受器层厚度显著减少28% (P < 0.01)，表明光感受器细胞丢失（图8）。

图8 DA暴露对斑马鱼胚胎光感受器层的影响。(A) H&E染色的对照和DA处理斑马鱼胚胎视网膜切片。光感受器层用白色条标记。(B) 光感受器层厚度用ImageJ软件测量。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 5）表示。**P < 0.01。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮。

进一步通过检测视杆细胞（使用抗视杆蛋白抗体）和视锥细胞（使用ZPR1抗体）来调查丢失的光感受器类型。作者发现DA处理使视杆细胞的荧光信号显著减少48.6% (P < 0.01)（图9A）；同样，视锥细胞的荧光信号也显著减少26.6% (P < 0.01)（图9B）。

图9 DA暴露对斑马鱼胚胎光感受器的影响。(A) 未处理和DA处理的斑马鱼胚胎视网膜切片中通过抗视杆蛋白抗体（绿色信号）检测视杆细胞。对荧光信号进行量化并比较两组。(B) 未处理和DA处理的斑马鱼胚胎视网膜切片中通过抗arrestin抗体（红色信号）检测视锥细胞。为了量化荧光信号，选择未处理和DA处理斑马鱼胚胎的5 只眼睛的10 个视网膜切片（每只眼睛2 个切片）。使用ImageJ软件对10 µm × 10 µm（400倍放大）区域的荧光信号进行量化。数据通过非参数t检验进行分析，结果以均值±标准误（n = 5）表示。**P < 0.01。

Conclusion

DA处理导致人RPE细胞活力显著降低，抗氧化能力下降，炎症和细胞凋亡增加；DA暴露导致斑马鱼胚胎孵化延迟，心跳减慢，形态异常和死亡；在斑马鱼胚胎中，DA还诱导了视杆细胞和视锥细胞的死亡。这些数据表明，食用受DA污染的海鲜可能对人类视网膜产生潜在毒性。

Toxicity of a seafood toxin, domoic acid, in the retina via modulation of the NRF2 and NF-κB pathways

Gabriel Mbuta Tchiveleketea,b,1, Yanqun Caoc,1, Mohammad Almarhouna, Xinzhi Zhoua, Agostinho Francisco Cachapab, Sebastião Tumitânguab, James Reillya, Patricia E. Martina, Xinhua Shua,c,d,*

aDepartment of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, Glasgow G4 0BA, UK

bDepartment of Marine Biology, Faculty of Natural Science, University of Namibe, Moçâmedes CP 274, Angola

cPu Ai Medical School, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China

dDepartment of Vision Science, Glasgow Caledonian University, Glasgow G4 0BA, UK

1 These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author.

Abstract

Domoic acid (DA), a biotoxin, is produced by several species of marine dinoflagellate and diatom during harmful algal bloom events. DA is a neurotoxin, in humans and non-human primates, oral exposure to DA results in gastrointestinal effects, while DA at higher doses leads to neurological symptoms, seizures and memory deficiency. Exposure of humans to DA occurs mainly through consumption of contaminated seafoods containing an accumulation of the toxin. Previously, it was unclear if DA can have toxic effects on the retina. We assessed the toxicity of DA in human retinal cells (ARPE-19) and in zebrafish embryos. DA significantly lowered ARPE-19 cell viability dose-dependently, and decreased anti-oxidative capacity, increased inflammation, and promoted cell death, possibly through modulating the NRF2 and NF-κB signalling pathways. Zebrafish embryos exposed to DA for 4 days from 1 day post fertilization (dpf) had an increase in mortality and a decrease in both hatching and heartbeat rate and exhibited morphological abnormalities. DA treatment also significantly downregulated expression of antioxidant genes and upregulated expression of inflammation mediators, as well as causing photoreceptor death in zebrafish embryos. The results demonstrate that consuming seafood containing DA will have potential toxic effects in human retinas.

Reference:

Tchivelekete G M, CAO Y Q, Tchivelekete M, et al. Toxicity of a seafood toxin, domoic acid, in the retina via modulation of the NRF2 and NF-κB pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250113. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250113.

文章翻译：管勤昊（实习）

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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