《食品科学》：天津科技大学李红娟副教授等：湿热磷酸化提升乳清蛋白热稳定性的作用与机制

乳清蛋白是牛乳中的一种重要蛋白质，具有较高的营养价值和较好的功能特性。然而，乳清蛋白在高温、高蛋白浓度条件下易发生凝固、沉淀和氧化等问题，限制了其在高蛋白饮料、运动食品、特医食品等领域的应用。研究表明，乳清蛋白溶液经85 ℃以上的热处理会发生变性和聚集，并且在超过10%的蛋白质含量条件下，往往会形成热诱导凝胶。因此，提高乳清蛋白的耐热性仍然是一个严峻的挑战。

磷酸盐是指由磷酸（ H 3 PO 4 ）和金属离子形成的一类无机化合物，作为食品添加剂（如增稠剂、稳定剂、乳化剂）广泛应用于奶制品、肉制品、速冻食品和调味品中。有研究表明，磷酸盐可以通过螯合金属离子有效提高含乳清蛋白溶液的热稳定性，使乳清蛋白在140 ℃条件下热絮凝时间增加了10～30 min，这使其在加热处理时更稳定，能保持其结构和功能特性。对乳清蛋白进行热处理是一种常见的物理改性方法，通过改变加热时间、温度、pH值以及盐离子使其具有不同的特性。加热可以促进磷酸化程度，干热磷酸化已经被开发应用于蛋白改性中。有研究发现，在特定的磷酸化条件下湿热改性增加了乳清蛋白的持水性。增强持水性可以保持蛋白质的水合状态，能够阻止蛋白质在加热过程中由失水引起的变性和不稳定性。

天津科技大学食品科学与工程学院的董暄、李红娟*和中国农业科学院农产品加工研究所的张书文*等人以乳清分离蛋白（WPI90）和多种磷酸盐为原料，在不同温度和pH值条件下对乳清蛋白进行湿热磷酸化改性，系统探究多个磷酸盐在不同制备条件下通过湿热磷酸化改性对乳清蛋白热稳定性的影响，以解决高浓度乳清蛋白难以通过超高温灭菌处理或在加热过程中发生絮凝沉淀的问题。通过评价不同磷酸盐和加热温度对改性后乳清蛋白溶解性及热稳定性的影响，从而得到提高乳清蛋白热稳定性适宜的磷酸化条件，为后续进行高蛋白饮料产品开发提供现实依据。

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磷酸化乳清蛋白热稳定性的宏观结果

分别选取STPP、SHP、DSP、SHMP、SPP在不同pH值（6.8、7.0、7.2）和温度（75、80、85 ℃）条件下进行湿热磷酸化改性，观察对高浓度乳清蛋白溶液热稳定性的影响。由图1可知，DSP组在温度和pH值范围内均出现热凝固现象。STPP组、SHP组、SPP组在pH 6.8条件下出现流动性降低、黏度增大的现象，并且STPP组在pH 7.2条件下形成了不透明凝胶。在pH 7.0的3 个温度条件下，STPP、SHP、SHMP、SPP的添加能够有效抑制热絮凝的发生。Mariana等也同样发现在pH 7.0条件下，添加SHMP的乳清蛋白热稳定性得到提升。结果表明，特定的磷酸化条件在一定程度上可以有效提高乳清蛋白的热稳定性，表现出与微粒化乳清蛋白（WPC550）相近的耐热特性。故选取在pH 7.0所有温度范围内添加STPP、SHP、SHMP、SPP的磷酸化条件作进一步探究。

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游离巯基含量分析

如图2所示，磷酸化后乳清蛋白游离巯基的含量变化较为明显，在不同温度条件下添加SHP制备得到的磷酸化蛋白游离巯基含量较WPI90均呈现出上升趋势，这可能是由于SHP通过其高离子强度以及可能发生的共价修饰破坏了乳清蛋白（WPI90）的天然紧密结构，使其发生去折叠，将原本包埋在蛋白质分子内部的游离巯基暴露到了分子表面。在制备温度75 ℃条件下，STPP、SHP、SHMP组的游离巯基含量高于WPI90组，这可能是由于大部分链状的磷酸盐可以与乳清蛋白上含氨基或羟基的丝氨酸或者苏氨酸结合，而与含巯基的半胱氨酸结合较差，因此促进了游离巯基暴露。对照WPC550的游离巯基含量显著高于磷酸化蛋白（

P

＜0.05），这是由于微粒化蛋白在制备过程中首先使蛋白发生热聚集随后对其进行机械处理，导致游离巯基暴露至蛋白质分子表面，分子间的游离巯基与二硫键发生了交换反应，形成分子间二硫键，使微粒之间发生交联，从而粒径增大，沉淀率升高，溶解度降低。

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表面疏水性分析

表面疏水性是衡量蛋白质链中疏水性氨基酸暴露程度的指标。如图3所示，相较于对照WPI90，在75 ℃条件下添加不同磷酸盐制备的磷酸化乳清蛋白，表面疏水性整体降低，可能是由于添加了磷酸盐后，磷酸基团与乳清蛋白氨基酸残基发生结合，增加了蛋白表面净负电荷，使蛋白质表面的疏水性氨基酸残基更容易与水发生结合，从而降低表面的疏水性。而在85 ℃条件下制备的磷酸化蛋白暴露出更多的疏水部分，这种效应可能是由于在85 ℃条件下，较高的温度使乳清蛋白结构部分展开，磷酸基团与蛋白质的共价结合固定构象部分展开，疏水残基被暴露在蛋白表面，从而增加了表面疏水性。对照WPC550具有最高的表面疏水性，这是由于微粒化蛋白在加工过程中变性程度大，破坏了蛋白质的三级结构，使疏水残基暴露至表面，导致表面疏水性增加，这些暴露的疏水基团会相互结合，形成不溶性聚集体，从而降低蛋白的溶解性。

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钠磷钙盐含量分析

如表2所示，添加不同的磷酸盐后蛋白体系中的钠和磷含量较未改性样品WPI90显著增加（

P

＜0.05），其中，SHP组的钠和磷含量与对照WPC550最接近。理论上，SHMP携带的钠和磷更多（6 个），SHP携带的钠和磷相对较少（1 个），但结果显示STPP组的钠和磷含量最高，SPP组的钠和磷含量最低，这可能是由于STPP属于线性结构，而SHMP是环状结构，因此其钠和磷的含量低于理论值；SPP携带的 P 2 O 7 4－ 具有较高的稳定性，不易被水解释放磷，因此钠和磷含量都较少。相比较对照WPI90，磷酸化蛋白整体的可溶性钙和总钙含量更低（

P

＜0.05）。钙含量的减少能够使蛋白在加热过程中的絮凝情况减少。结果表明，磷酸盐对蛋白体系中的金属离子均有不同程度的螯合作用，这与李妍等的研究结论一致，但磷酸盐的螯合作用并不是提高蛋白热稳定性的唯一机制。其中SHP和SPP对钙离子的螯合作用更大，这可能是由于SHP携带的 H 2 PO 4 － 可以在中性条件下解离为 HPO 4 2－ ， HPO 4 2－ 能够与 Ca 2＋ 形成可溶性络合物（ CaHPO 4 ），SPP携带的 P 2 O 7 4－ 是非刚性结构，能与 Ca 2＋ 形成稳定的环状螯合物，因此二者对钙离子的螯合作用更强。虽然理论上SHMP的螯合能力最强，但其环状结构需要先解离为线性结构才能更有效地螯合，因此在短时处理中螯合效率低。

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蛋白二级结构分析

添加磷酸盐后乳清蛋白的二级结构发生了明显的改变。Hu Zhenying等证实磷酸化处理可以改变蛋白的二级结构。拟合得到的二级结构含量结果见表3。与未改性的WPI90相比，磷酸化后的乳清蛋白

-折叠相对含量整体显著降低（

P

＜0.05），而

-转角相对含量增加，这与Yan Chunjun等研究磷酸化蛋白二级结构结论一致。这是可能由于磷酸化结合位点主要发生在

-折叠和无规卷曲上，会破坏

-折叠的氢键，从而使磷酸化后

-折叠含量降低。磷酸化引入了磷酸基团，磷酸基团带有强的负电性，增加了分子间的排斥力，使蛋白构象更松散，促进了

-转角的形成。

-螺旋位于疏水中心，其中

-螺旋增多可能意味着磷酸化后蛋白通过重构疏水相互作用增加了热稳定性。相较于对照WPI90和WPC550，在75 ℃磷酸化条件下，无规卷曲相对含量均发生了不同程度的增加，这可能是由于在75 ℃条件下乳清蛋白发生了部分变性，并且磷酸化使得蛋白内部结构发生改变，无规卷曲含量增加。

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磷酸化乳清蛋白热稳定性分析

6.1 UHT处理后的离心沉淀率变化

离心沉淀率是反映乳清蛋白溶液聚集性的直接指标，其越低表明乳清蛋白溶液体系越稳定，不同磷酸盐对乳清蛋白热稳定性的提升效果取决于其电荷密度、螯合能力及与蛋白质的相互作用机制。如图4所示，在不同制备温度下添加SHMP所制备得到的磷酸化蛋白离心沉淀率较低，均小于10%，这可能由于SHMP是环状多聚体磷酸盐，含有6 个磷酸基团，在与乳清蛋白相互作用时能提供更多磷酸化位点，从而与蛋白形成更紧密的网络状结构，使乳清蛋白的热稳定性显著提高。在75 ℃和80 ℃条件下制备得到的磷酸化蛋白较85 ℃的蛋白离心沉淀率更低。这可能由于在75 ℃和80 ℃条件下，乳清蛋白的结构部分展开，暴露出更多的氨基酸修饰位点，而较高的温度（85 ℃）能够加速多聚磷酸盐分解为单体磷酸盐，从而降低了乳清蛋白与磷酸盐的交联作用。Wang Xuewei等的研究也同样表明，温度越高越有利于多聚磷酸盐的水解。对照WPC550在加热前为流动性极好的乳状液，由于在加热过程中蛋白颗粒会因受热发生溶胀，因此沉淀率较高。

6.2UHT处理后的黏度变化

图5、6为不同制备条件下的磷酸化乳清蛋白在UHT处理前后表观黏度与剪切速率的关系。在UHT处理前，4 种磷酸盐组在所有温度条件下均表现出较低的表观黏度，而在热处理后均出现了黏度增大的现象，这是因为经过UHT处理后乳清蛋白发生热变性聚集，蛋白分子间摩擦力增大，流动性变差，从而导致黏度增大。WPC550具有优异的耐热特性，因此加热后的高蛋白溶液表观黏度仍较小。在热处理前，最低和最高的表观黏度分别对应SHMP组和SHP组。Mariana等发现在乳饮料中加入一定浓度的SHMP可以降低体系的黏度。在热处理后，在75 ℃和80 ℃条件下添加SHMP制备得到的磷酸化乳清蛋白溶液仍具有最低的表观黏度，表现出与WPC550相近的热稳定性。而在85 ℃条件下，SHMP组和STPP组的表观黏度明显增大，乳清蛋白溶液的热稳定性较75 ℃和80 ℃条件下有所降低，这与6.1节的结果相印证。

6.3UHT处理后的粒径变化

粒径能够反映乳清蛋白颗粒的体积，热处理后粒径越小，说明乳清蛋白溶液的热稳定性越好。由表4可知，UHT处理前的粒径整体较小（＜10 μm），而UHT处理后的粒径明显增大，这表明热处理会导致乳清蛋白发生聚集反应。对照WPC550在热处理前粒径大于其他样品，这是由在加工过程中先加热聚集随后剪切所导致，形成了较大的颗粒。有研究表明，溶液体系的表观黏度与粒径具有相关性，粒径越大表观黏度越大。SHMP组的磷酸化乳清蛋白经UHT处理后仍能保持较好的稳定性，其粒径相对较小，约为10 μm，与WPC550粒径相近，说明添加SHMP协同短时加热能有效提高乳清蛋白的热稳定性，降低乳清蛋白溶液体系的粒径。Guo等的研究也同样表明，湿热磷酸化可以减小颗粒的粒径。而SPP组经UHT处理后整体粒径较大，约为20 μm，粒径与乳清蛋白溶液的表观黏度变化基本趋于一致。

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磷酸化乳清蛋白的溶解性分析

溶解性是乳清蛋白的重要功能特性，磷酸化乳清蛋白的溶解性受磷酸盐浓度、pH值、加工手段等多种因素的影响。如图7所示，与WPI90相比，添加SHMP的部分磷酸化蛋白溶解度呈现出降低的趋势，这是由于SHMP酸性更强，添加SHMP后，乳清蛋白的等电点可能会向酸性方向发生偏移，从而使乳清蛋白的溶解性降低。除添加SHMP的磷酸化乳清蛋白以外，其他磷酸盐组在75 ℃条件下溶解度均得到提升。在75 ℃和80 ℃条件下SPP组的溶解度较85 ℃条件下更高，这可能是由于加热易促进蛋白质分子间的交联，会导致部分蛋白质发生热聚集，从而形成二聚体，使其在冷却后仍然难以溶解，降低了蛋白的溶解度。对照WPC550具有较低的溶解度，显著低于与其他组（

P

＜0.05），这是由于微粒化乳清蛋白在制备过程中发生了90%以上的变性，氢键发生破坏，蛋白质与水之间的相互作用减弱，造成溶解性下降。

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结论

本实验采用湿热磷酸化法改性乳清蛋白，综合评价不同磷酸化条件制备得到的乳清蛋白溶解性与热稳定性，并与微粒化乳清蛋白WPC550进行比较。结果显示，经过湿热磷酸化改性，乳清蛋白的内部结构和性能发生改变，在75 ℃的制备温度条件下，添加STPP和SHP得到的磷酸化乳清蛋白游离巯基含量相比于WPI90呈现不同程度的增加；在该制备温度下添加不同磷酸盐的乳清蛋白表面疏水性相比于WPI90有所降低。添加磷酸盐后，蛋白体系中的可溶性钙和总钙含量均减少，其中SPP和SHP的可溶性钙含量最低（＜3 mg/g），磷酸化乳清蛋白的钠和磷含量均有所增加，SHP组的钠和磷含量与WPC550最接近。通过磷酸化修饰，乳清蛋白的二级结构均发生改变，磷酸化后的乳清蛋白

-折叠含量整体降低，而

-转角含量增加，并且在85 ℃条件下制备的样品无规卷曲含量有所上升。除添加SHMP的磷酸化乳清蛋白以外，其他磷酸盐组在75 ℃条件下溶解性均得到提升，其中SPP组在75 ℃和80 ℃条件下的溶解性比85 ℃条件下好。添加SHMP在75 ℃和80 ℃条件下制备得到的磷酸化蛋白经UHT处理后具有较低的离心沉淀率和表观黏度，其整体粒径约为10 μm，与WPC550粒径最接近，具有与微粒化乳清蛋白相近的耐热特性，这表明乳清蛋白的热稳定性得到显著提高。乳清蛋白经过湿热磷酸化修饰后，其热稳定性和溶解性有所提高的原因包括：湿热处理会使乳清蛋白的结构部分展开，暴露出更多的磷酸化修饰位点，引入更多的磷酸基团，从而增加了乳清蛋白表面的负电荷，使蛋白分子间相互排斥，减少聚集；磷酸盐具有螯合金属离子的作用，可以减少蛋白在加热过程中盐桥的形成；磷酸化可以促进乳清蛋白之间的共价修饰与氢键的形成，从而增强蛋白质分子间的相互作用。以上结论表明适宜的湿热磷酸化条件可以显著提高乳清蛋白的耐热特性，有助于解决高蛋白饮料在UHT加工生产中发生沉淀变性的难题。

第一作者：

董暄硕士研究生

天津科技大学食品科学与工程学院

2023.09-至今：天津科技大学硕士研究生在读，2024.03-至今：中国农业科学院农产品加工研究所进行联合培养，完成课题研究。硕士期间研究方向为乳品加工与品质调控。

引文格式：

董暄, 路茹青, 逄晓阳, 等. 湿热磷酸化提升乳清蛋白热稳定性的作用与机制[J]. 食品科学, 2025, 46(24): 106-114. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250530-209.

DONG Xuan, LU Ruqing, PANG Xiaoyang, et al. Effect and mechanism of moist-heat phosphorylation on improving the thermal stability of whey protein[J]. Food Science, 2025, 46(24): 106-114. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250530-209.

实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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