专家论坛｜牛俊奇：乙型肝炎病毒基因组整合的研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球公共卫生面临的重大挑战，我国慢性HBV感染者约占全球总量的1/3。世界卫生组织估计，全球乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清流行率为3.2%，而中国一般人群HBsAg流行率高达5.86%，约涉及7 500万人，明显高于全球平均水平。作为肝硬化和肝细胞癌（HCC）的首要病因，HBV感染的防控形势依然严峻：尽管预防性疫苗可有效阻断新发感染，但慢性乙型肝炎（CHB）至今仍无法根治。

1HBV结构与复制周期

HBV属于嗜肝DNA病毒科，其病毒颗粒包裹着约3.2 kb的松弛环状双链DNA（rcDNA）基因组，该基因组由病毒自身编码的衣壳蛋白包裹。HBV基因组包含4个启动子区，驱动4个高度重叠的开放阅读框进行转录翻译，最终编码7种病毒蛋白：HBsAg（包括大、中、小3种形式）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、HBV聚合酶及HBV X蛋白。

HBV颗粒先与肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽受体高亲和结合并脱去外膜，核衣壳随之进入细胞质；随后衣壳解体，rcDNA被递送至细胞核。在核内，rcDNA借助宿主DNA修复酶系“修复”为共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA以游离微染色体形式长期存留，既转录产生编码结构蛋白和调节蛋白的亚基因组mRNA，也合成超过基因组全长度的前基因组RNA（pgRNA）；pgRNA与病毒聚合酶一起被新生的核心颗粒包裹，在衣壳内部逆转录生成rcDNA或双链线性DNA（dslDNA），经包膜后出芽释放。cccDNA的持久存在与dslDNA随机整合产生的iDNA，共同构成HBV难以根除的分子基础，两者持续提供病毒抗原，维持慢性感染状态。

2HBV DNA整合机制

在逆转录过程中，HBV聚合酶以pgRNA为模板，先在其3′端的ε茎环结构内合成一段DNA寡核苷酸作为引物，负链延伸的同时，RNA酶H降解大部分pgRNA，仅保留其5′端带帽的片段。这些RNA寡核苷酸［含直接重复序列（DR）1］作为正链引物，通常转移并结合至负链上的DR2区域启动合成，最终形成占90%～95%的rcDNA。若DR2互补效率因突变降低，引物可直接在DR1延伸，形成5%～10%的dslDNA。dslDNA是HBV DNA整合的首选底物，其入核后，借助宿主非同源末端连接等修复通路随机插入染色体（图1）。此外，肝脏炎症期氧化应激造成的肝细胞DNA断裂更为其提供了“现成入口”。

注： HBV cccDNA首先转录为pgRNA；随后，pgRNA经逆转录主要形成rcDNA，同时少量产生dslDNA。dslDNA可随机插入宿主基因组，产生双重后果：一方面，整合片段持续翻译大量HBsAg，诱导T细胞与B细胞进入免疫耐受状态；另一方面，携带iDNA的肝细胞获得潜能未定的克隆性增殖优势，逐步进展为HCC。cccDNA，共价闭合环状DNA；pgRNA，前基因组RNA；rcDNA，松弛环状双链DNA；DR，直接重复序列；dslDNA，双链线性DNA； HbsAg，乙型肝炎表面抗原；PreS1/S2，前S1/S2；TIM3，T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3；PD1，程序性死亡受体1；AAA，poly（A）尾。

图1 HBV DNA整合的机制及作用

基于rcDNA与dslDNA这两大底物，学界归纳出6种整合范式：（1）“单链缺口”模型：rcDNA正链存在缺口，宿主DNA聚合酶在基因组复制时“跳读”至邻近HBV正链的5′单链区，随后发生重组，形成病毒-宿主融合；（2）DR介导的位点特异性重组模型：病毒DR1或DR2与宿主基因组中同源序列发生位点特异性重组，无需大片段同源性，实现精准插入；（3）“微同源”模型：宿主DNA与HBV rcDNA之间仅需3～8 bp的微同源序列即可引导聚合酶切换模板，重组断点即由该微同源区决定；（4）“滚入”模型（dslDNA专用）：dslDNA的游离末端直接“侵入”宿主DNA的单链断裂位点，通过链置换合成建立宿主-病毒连接；（5）“staggered黏端插入”模型：rcDNA负链在衣壳组装前脱离复制复合体；宿主DNA产生交错断裂形成黏性末端，不完整的病毒基因组嵌入后，两侧留下12 bp的“非病毒-非宿主”DR。（6）非同源末端连接/微同源末端连接依赖模型：dslDNA先去除末端的聚合酶蛋白与5′帽结构，随后借助宿主非同源末端连接或微同源末端连接插入DNA双链断裂位，其中微同源末端连接的插入方向由微同源序列决定。值得注意的是，上述机制并非互斥；整合一旦建立，局部基因组不稳定性及转座子活性仍可造成二次重排或“再易位”，从而持续重塑病毒-宿主基因组景观。

3整合HBV DNA的分布特征

HBV dslDNA可整合至宿主所有染色体的任意位点，但其插入并非完全随机，表现为显著富集于转录活跃的基因组区域。肝细胞分裂过程中，携带特定iDNA的子代细胞可能因获得生长优势而发生克隆性扩增，逐步演变为癌前病变结节，最终进展为HCC。其中，人类TERT（端粒酶逆转录酶基因）及组蛋白甲基转移酶基因MLL4（KMT2B）是最常见的热点整合位点。HBV DNA整合片段通常保留从DR1至DR2的完整区域，涵盖HBsAg全编码序列，因而主要表达表面抗原蛋白。近期研究进一步揭示，相较于cccDNA来源的HBsAg，整合来源的HBsAg分泌效率显著降低，其分子机制主要是整合片段的核心启动子功能缺陷，导致增强子Ⅰ对preS1/preS2启动子的激活作用失衡，引发表面抗原大蛋白（L-HBsAg）过量表达，进而抑制表面抗原的整体分泌效率。然而，这些滞留在细胞内的L-HBsAg是否反向重塑整合位点附近的染色质微环境，尚需进一步验证。

4HBV DNA整合的发生时相

HBV DNA整合事件贯穿慢性HBV感染的全过程。在慢性感染自然史的4个时期中，肝组织内均可检测到HBV cccDNA与iDNA。甚至在感染早期（包括儿童阶段）即可在肝组织和血清中检出iDNA。值得注意的是，急性HBV感染期同样可检出病毒DNA整合。然而，cccDNA与整合HBV DNA的相对丰度在不同感染阶段存在显著差异。HBeAg阳性期以cccDNA为主，而HBeAg阴性期则表现为整合HBV DNA占主导。郭海涛教授团队的研究阐明了这一转变的机制：免疫耐受期病毒大量复制产生dslDNA，部分发生整合，此阶段HBsAg主要来源于cccDNA；经历免疫清除期后，携带cccDNA的肝细胞被免疫系统清除而减少，而含iDNA的肝细胞不易被清除，同时新生肝细胞受HBV感染并形成新的整合；在HBeAg阴性期，携带整合HBV DNA的肝细胞得以存活，且整合片段所含的增强子区可促进肝细胞异常克隆性扩增，此时HBsAg主要来源于整合的HBV DNA。最新观点认为，整合HBV DNA的肝细胞比未整合的肝细胞更容易发生再次整合事件。

HBV DNA整合不仅是病毒持续感染的表现，更可能是一种主动参与肝脏疾病进程的机制。随着cccDNA池在免疫压力下被逐步减小，整合HBV DNA因其不易被免疫系统识别清除的特性，逐渐在疾病进程中发挥驱动作用。

5整合HBV DNA对机体的影响

整合HBV DNA对机体的影响主要体现在致癌与诱导免疫耐受两方面（图1）：

5.1 致癌作用

HBV DNA整合是HCC发生的关键分子事件。CHB向HCC进展的过程中，携带整合的肝细胞克隆所占比例逐渐增加，当整合事件发生在HCC相关基因（如TERT启动子区或MLL4基因区）附近或内部时，可启动致癌级联反应，从HCC原始细胞扩增，进展为具有致癌整合的细胞克隆性增殖，最终发展为HCC。新近研究亦发现，新的HBV整合相关致癌基因如卷曲螺旋结构域含有蛋白91，其通过HBx蛋白C-末端截短突变/卷曲螺旋结构域含有蛋白91/乳酸脱氢酶A信号轴发挥促癌作用。然而HBV插入所致癌症相关基因的遗传学改变及致病机制仍远未阐明。

5.2 免疫耐受

整合HBV DNA的持续转录可导致HBsAg过量表达，进而诱导机体产生免疫耐受。一方面CHB患者体内HBsAg特异性B细胞分化缺陷，无法产生抗-HBs抗体。HBsAg特异性和整体B细胞中积累了CD21–CD27–非典型记忆B细胞，这些细胞高表达包括程序性死亡受体1（PD-1）在内的抑制性受体，在信号传导、归巢及抗体产生等方面表现异常，促进了PD-1高表达非典型记忆B细胞的产生，并损害了B细胞的免疫反应。另一方面，在慢性HBV感染过程中，由于持续暴露于表面抗原和炎症刺激，免疫检查点分子（PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、淋巴细胞活化基因3）常呈高水平且共表达状态，介导T细胞的功能耗竭。

CHB功能性治愈的核心标志是血清HBsAg的消失。HBsAg由cccDNA和整合到宿主基因组中的整合HBV DNA共同编码，且后者的转录不受核苷（酸）类似物抑制，导致基于此类药物的治疗难以实现HBsAg血清学清除。

HBsAg的持续表达所造成的免疫耐受，已成为CHB实现功能性治愈的主要障碍之一。未来的抗病毒治疗策略应着眼于整合片段的清除或抑制，同时通过激活机体免疫或阻断PD-1或淋巴细胞活化基因3等途径以实现免疫耐受的“松绑”，才有可能打破由HBV DNA整合所维持的耐受闭环。

6抗病毒治疗对HBV DNA整合的影响

现有抗病毒药物在降低病毒载量的同时，亦可减少整合HBV DNA水平。一项关于富马酸替诺福韦二吡呋酯的随机双盲、安慰剂对照临床试验表明，为期3年的治疗可显著降低CHB患者肝内整合型与非整合型HBV DNA的载量。本研究团队观察到恩替卡韦治疗48周可使免疫清除期的CHB患者肝内HBV整合位点总数明显下降，且断点集中分布于HBV基因组nt1 600～1 900区域。核苷（酸）类似物治疗通过缩小cccDNA池以减少新整合事件的发生，长期治疗可使cccDNA与整合HBV DNA水平持续下降。干扰素治疗亦具有减少病毒整合的作用，研究显示实现功能性治愈的患者，其肝内整合HBV DNA的数量及其转录水平均显著低于未治愈组。然而，目前尚缺乏评估免疫耐受期CHB患者接受核苷（酸）类似物治疗获益的临床研究，因此早期启动抗病毒治疗能否有效阻断HBV DNA整合并降低远期HCC风险，仍有待进一步验证。

近年来，以RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸为代表的新型抗病毒药物已相继进入临床试验阶段，并展现出确切的疗效与良好的安全性。RNAi药物ARC-520的Ⅰb期临床试验结果显示，该药可实现HBsAg与HBV RNA的持续显著下降，部分患者肝组织HBsAg阳性染色比例降至10%以下。尽管该研究未直接探讨ARC-520对HBV DNA整合的影响，但治疗后HBsAg显著下降，提示ARC-520可能减少了HBV DNA整合来源的HBsAg。另一项反义寡核苷酸药物Bepirovirsen的Ⅱb期试验表明，每周300 mg治疗24周可使9%～10%的慢性HBV感染者实现持续的HBsAg与HBV DNA消失。这一比例远高于核苷（酸）类似物治疗12个月后不足5%的HBsAg清除率，提示反义寡核苷酸类药物亦可能通过靶向iDNA转录的mRNA而降低其病毒学贡献。综上所述，这些新型疗法为攻克HBV DNA整合这一功能性治愈的关键障碍带来了新希望。

7小结

HBV DNA整合是CHB功能性治愈和肝癌防控必须攻克的关键障碍。病毒逆转录产生的5%～10% dslDNA随机插入宿主染色体，优先整合至转录活跃区，可即时激活致癌基因或导致基因组不稳定。其整合片段持续表达的HBsAg会诱导B细胞与T细胞功能耗竭，形成免疫耐受，使得即便通过核苷（酸）类似物沉默cccDNA仍难以实现HBsAg阴转。尤为关键的是，HBV DNA整合贯穿感染全程，在HBeAg阴性期因cccDNA被免疫清除而iDNA占比反超，成为HBsAg主要来源，并借助其增强子序列赋予肝细胞克隆扩增优势，逐步累积癌前突变。长期核苷（酸）类似物治疗可通过抑制病毒复制减少新整合事件，而干扰素治愈者的整合数量及转录活性均显著降低。新型抗病毒药物如RNAi与反义寡核苷酸可能同时靶向cccDNA和iDNA来源的HBsAg转录本，为“双途径阻断”提供了可能。未来亟需开发能靶向整合断点、表观沉默iDNA或特异性清除整合克隆的新策略，从而将降低肝癌风险与提升功能性治愈率从具有“统计学意义”切实转化为“临床现实”。

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https://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.12449/JCH260104

引证本文 Citation

王垚鑫, 王晓美, 牛俊奇. 乙型肝炎病毒基因组整合的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2026, 42(1): 21-25

来源：临床肝胆病杂志

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