《食品科学》：中国农业科学院孟璐博士等：产芽孢细菌检测方法的研究进展

有些细菌当生长到一定时期时，繁殖速度下降，原生质收缩，在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的、对不良环境条件具有较强抗性的休眠体，称为芽孢或内生孢子。芽孢是细菌的休眠体，一个细胞内只形成一个芽孢，一个芽孢萌发也只产生一个营养体。芽孢可以在极端环境中生存并休眠数年，还能够抵抗高温、干燥、辐射和有毒化学物质等恶劣环境。在自然界中，芽孢通过水、风等寻找营养环境。因此，它们普遍存在于地球上，并不可避免地进入食物链。此外，芽孢极具耐热的特性使其能够在各种食品灭菌过程中存活。当环境合适时，食物中的芽孢可萌发并进入营养生长阶段，进而引发食品腐败变质，甚至引发食源性疾病。

芽孢不仅具有致病性，还有很强的致腐能力。因此，对食品中存在的芽孢进行检测是一项非常必要的工作。

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的和晓兰、郑楠、孟璐*等对食品中芽孢的各种检测方法进行总结和整理，如国内外最常采用的培养法、核酸扩增法、流式细胞术等，以期为产芽孢细菌检测领域提供基础知识和研究背景。

01

基于常规培养的检测方法

联合国粮食及农业组织食品法典委员会和世界卫生组织法典标准规定，婴儿配方奶粉中蜡样芽孢杆菌的最大可接受数量为102 CFU/g。然而，仍然缺乏可靠的方法及时检测低水平的蜡样芽孢杆菌芽孢（＜102 CFU/g）。大多数方法只适用于营养细胞的检测，芽孢的检测需要多一个让其萌发的步骤。ISO7932:2004/AMD1:2020《食品和动物饲料的微生物学 假定性蜡芽孢杆菌的水平计数法 在30 ℃条件下的菌落计数技术》中规定了食品和动物饲料中蜡样芽孢杆菌的30 ℃菌落计数法，ISO 21871:2006《食品和动物饲料的微生物学 少量假定蜡样芽孢杆菌测定法 最大可能数技术和检测办法》中规定了食品和动物饲料中少量蜡样芽孢杆菌的最可能计数法。法国标准化协会发布的NFV08-405-1986《食品微生物学 罐头 嗜热梭状芽孢杆菌的检测》中规定了罐头中嗜热梭状芽孢杆菌的检测。摩洛哥NM08.0.170-2013《食品微生物学 罐头食品的原料 嗜热芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌耐热孢子的计数 最可能计数法》中规定了罐头食品原料中嗜热芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌、耐热芽孢的最可能计数法。

目前，我国标准中常用到的也是培养鉴定法，检测时间受鉴定方法和菌种而异。GB 4789.14—2014《食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》中蜡样芽孢杆菌检测采用平板计数法和最可能数（MPN）法，平板计数法用于含量较高的食品中蜡样芽孢杆菌的计数，MPN法适用于含量较低的食品中蜡样芽孢杆菌的计数，检测时间为5～7 d。对于芽孢的检测标准，我国只有NY/T 1331—2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》规定了乳与乳制品中需氧芽孢总数的测定，先80 ℃热处理10 min，再36 ℃培养48 h；对于嗜热需氧芽孢的检测，先100 ℃热处理30 min，再55 ℃培养48 h。SN/T 0178—2011《出口食品嗜热菌芽胞（需氧芽胞总数、平酸芽胞和厌氧芽胞）计数方法》中规定了谷物产品、食品配料和固态乳品（全脂奶粉、脱脂奶粉和奶酪制品）中嗜热菌芽孢的计数，106 ℃热处理30 min，再55 ℃培养48 h。

培养分离鉴定法灵敏度高，但需要大量的人力，且操作繁琐、耗时长。使用常规培养方法鉴定特定细菌种类是一个漫长而困难的过程。MPN计数中，需要通过一系列进一步的生理生化实验确认是否为特定细菌。由于阳性样品的鉴定需要几天的时间，而且无法使用特定的媒介或表型标记区分不同的物种，这种方法往往难以适应生产过程的需要。对此，有很多学者对常规的培养法进行了研究和改进。Eijlander等研究发现100 ℃加热30 min与106 ℃加热30 min具有相同的预测值。Murphy等研究发现一般耐热芽孢为80 ℃热处理12 min，32 ℃培养48 h；中等耐热芽孢为100 ℃热处理30 min，55 ℃培养48 h；极度嗜热芽孢为106 ℃热处理30 min，55 ℃培养48 h是奶粉中芽孢可靠计数的最佳方法。检测限达10 CFU/mL。Brändle等开发了一种基于光密度值和阻抗水平的对梭状芽孢杆菌具有最佳选择性的培养液，能够通过培养物光密度值随时间的变化从而检测梭状芽孢杆菌芽孢的萌发和生长，检测限达30 spores/L。

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基于核酸扩增的检测方法

聚合酶链式反应（PCR）是一种检测和扩增生物体中DNA（或cDNA）的方法。原则上，这种技术类似于体内转录和克隆。通过变性、退火和延伸过程，从每个双链DNA分子中获得一条新的和一条旧的DNA链，新产生的DNA片段在随后的循环中充当模板，这使得DNA靶被指数扩增数百万倍。近年来，基于核酸扩增的原理，开发了很多检测不同产芽孢细菌和芽孢的方法，如荧光定量PCR法、环介导等温扩增法和实时荧光重组酶聚合酶等温扩增法等（表1）。PCR具有特异性强、灵敏度高、简单快速、成本低、样本需求量小等优点，同时由于食品物质和化学物质的存在会抑制PCR，造成假阴性。Cecere等利用甲酚红染料对pH值的敏感性，开发了能够通过荧光或肉眼读数的比色环介导等温核酸扩增法，对检测牛奶样品中的酪丁酸梭菌芽孢具有特异性高、灵敏度高等优点。Mertens等评估了11 个商业DNA提取试剂盒，用于实时定量PCR（qPCR）检测乳制品中的炭疽芽孢杆菌芽孢，结果表明qPCR检测结果直接取决于针对单个食品基质和细菌制剂所用的DNA提取方法。

另外，随着PCR的广泛使用，也出现了PCR方法结合其他新检测技术的研究。Létant等开发了一种基于PCR的最可能计数法，具有很好的特异性。杨大伟等报道了一种PCR结合变性高效液相色谱检测凝结芽孢杆菌的新方法，以凝结芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基为靶基因对PCR体系进行优化，可以灵敏地检测最低量为100 CFU/mL的凝结芽孢杆菌。

03

基于染料荧光的检测方法

基于染料荧光的检测方法是借助碘化丙啶（PI）、SYTO系列、5-羧基荧光素二乙酸酯（cFDA）等荧光染料，使用荧光显微镜、流式细胞仪等设备，通过营养细胞和芽孢不同的形态和荧光强度的特性，进行营养细胞和芽孢的定性、定量检测。作为一种高通量、高含量的单细胞分析技术，流式细胞术广泛应用于医学研究领域，随着研究的深入，畜牧业、食品业等领域应用也越来越频繁。进入流式系统的细胞被控制高速定向通过细管，细管处会有一束来自照亮光源的光束，当细胞通过时，光束产生不同程度的散射信号，被分别负责前向散射和侧向散射的探测器所接收，前向散射通常与细胞的大小呈正相关，而侧向散射与细胞的复杂程度呈正相关，从而得到不同的流式细胞图像。利用荧光显微镜能够清楚地观察到细胞发出的荧光颜色和强弱，通常会被用来验证流式细胞术的圈门结果。近年来，有许多使用流式细胞术测定益生菌和致病菌芽孢的报道（表2）。Somerton等对4 种不同荧光染料技术的流式细胞术与平板计数法对牛奶中蜡样芽孢杆菌的计数进行了比较，结果发现，cFDA-PI、CellROX™ Green-PI和3,3’-二己基氧杂羰花青碘化物（DiOC）染料技术与平板计数具有相似的准确性，而SYTO 24-PI染料技术准确性不佳。

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基于DPA的检测方法

DPA是芽孢的特有物质，通常以钙盐的形式存在，占芽孢干物质的5%～15%，在稳定细菌DNA和维持其正常功能方面起着重要作用。它被视为芽孢微生物的一种合适的临床生物标志物。对于DPA的检测，有分光光度法、拉曼/表面增强拉曼散射法、红外光谱法、荧光和光致发光法等。近年来，通过检测DPA含量计数环境和食物中的芽孢研究不断被报道（表3）。Cable等比较了Sm、Eu、Tb和Dy配合物与大环1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸酯（DO2A）与相应的镧系元素水离子的有效性，发现Tb(DO2A)+二元复合物是一种快速、稳健的DPA受体，用于检测细菌芽孢。Li等报告了一种基于荧光聚芴点作为支架与镧系离子协调的荧光传感器，借助吡啶二羧酸钙的敏化作用，能够检测到含0.2 nmol/L的吡啶-2,6-二甲酸钙（CaDPA）。Cowcher等使用改进的银胶体底物表面增强拉曼散射对芽孢杆菌属芽孢的生物标志物DPA进行便携式定量检测，检测限达29.9 nmol/L。Pu Shan等将Tb3+与谷胱甘肽（GSH）修饰的铜纳米团簇（CuNCs）结合，构建了一种基于Tb-GSH-CuNCs的聚集诱导发光（AIE）荧光探针，结合多色传感和智能手机应用程序使其成为可通过肉眼识别的便携式平台，用于在0.5～70 μmol/L范围内量化DPA，在现场环境监测中展现出巨大潜力。Jiang Guangzheng等使用天然墨鱼骨衍生有机基质（CDOM）/银纳米颗粒检测蜡样芽孢杆菌芽孢的DPA，能够在30 min内完成牛奶等食品中40～1 000 nmol/L的DPA定量分析。

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其他检测方法

对于芽孢的检测，除了研究较多的PCR法、流式细胞术和微量DPA检测法外，还有基于芽孢与纳米粒子结合成复合体的物理化学变化、芽孢抗原与标记抗体的特异性结合、质谱、色谱等方法定量芽孢的报道（表4）。Rizzotto等将5’端化学修饰的硫醇基团BAS6R共价连接到金纳米颗粒（AuNPs）上，结合并聚集到芽孢表面，再通过芽孢/BAS6R@AuNPs复合体催化过氧化氢介导的四甲基联苯胺（TMB）氧化并诱导颜色变化定量水、牛奶和土豆泥中的产毒素芽孢杆菌芽孢，检测速度快、成本低、特异性高，水和牛奶的检测限为102 CFU/mL，土豆泥的检测限104 CFU/mL。Daufouy等描述了一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢特异性适配体的选择方式，是未来开发专门用于检测嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的生物传感器的起点。Whiteaker等通过质谱仪检测芽孢中的小酸溶蛋白，并与芽孢浓缩方法相结合，能够在90 min内检测出炭疽芽孢杆菌芽孢含量，检测限达104 spores/mL。Dybwad等建立并验证了实验室基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析方法，能够在30 min内鉴定出可疑粉末样品中的炭疽芽孢杆菌芽孢，具有快速、特异、敏感、稳健等优点。Ryzhov等采用MALDI-TOF-MS快速表征了蜡样芽孢杆菌的芽孢，通过电晕放电等离子体（CPD）或超声处理芽孢，将蜡状芽孢杆菌群的芽孢与枯草芽孢杆菌和球状芽孢杆菌的芽孢区分开。

此外，宏基因组测序和全基因组测序等DNA测序技术也逐渐应用于芽孢的检测。与传统的培养法相比，宏基因组测序避免了培养过程的误差，缩短了检测时间，能够区分属水平的所有细菌和识别到在培养过程中不易识别或不易培养的芽孢菌种。Li Ning等采用宏基因组测序方法比较了我国4 个季节6 个地区的165 份生乳样品，共鉴定出4 个属207 种芽孢，还发现季节性变化对原料奶中芽孢的组成和丰度的影响大于地区。McHugh等使用鸟枪法宏基因组测序技术检测了乳清粉中的芽孢，并认为鸟枪法宏基因组测序在检测芽孢方面具有重要价值，有助于产品加工工艺的优化，能够降低芽孢污染风险。全基因组测序是对单个菌落的整个基因组进行测序的过程，提供了目标细菌的基因组序列信息，能够实现对目标菌株的准确分型，有助于揭示系统发育和进化趋势以及控制芽孢的方法。同时，能够反映出目标细菌本身带有的与毒素、脂肪酶、蛋白酶和生物膜形成等有关的基因情况。Sornchuer等对从食品中分离出的蜡样芽孢杆菌菌株进行了全基因组测序，探讨了与蜡样芽孢杆菌耐热表型相关的蛋白、机制，以及与抗生素耐药性和毒力相关的基因。Li Fang等对脱脂奶粉中的23 株分离株进行了全基因组测序，结果有16 株被鉴定为地衣芽孢杆菌，4 株为

Bacillus paralicheniformis

Bacillus

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结 语

芽孢检测培养法进行检测需要至少48 h，如果再加上生理生化鉴定，需要5～7 d，只能达到追溯的目的，实践性较低。PCR法和流式细胞术可以很好地解决这一问题，把检测时间缩短在1 d之内。PCR法具有简单快速、特异性高、灵敏度高、结果可靠、成本低、易于标准化等优点，然而由于食品杂质的影响，扩增效率受到限制，存在一定的假阴性。流式细胞术具有简单快速、灵敏度高、特异性高等优点。相比于检测高浓度细菌，当细菌浓度较低时，流式细胞术花费时间延长，检测结果准确度下降。新出现的检测方法是基于芽孢中的特有物质DPA，通过DPA的含量对芽孢定量分析。目前的研究是利用镧系元素（铕离子、铽离子）与DPA发生荧光敏化作用，提高荧光强度实现芽孢检测。这种方法能适用于现场检测的需要，具有实时快速、灵敏度高、准确度高、稳定性强等优点。其他还有通过抗原抗体特异性结合、质谱、色谱等方法也能够实现芽孢的快速实时检测，具有准确率高、特异性高、灵敏快速等特点。

目前，关于芽孢的快速检测方法，大多数是针对炭疽芽孢杆菌。这是因为炭疽芽孢杆菌为人畜共患病原菌，具有严重的致病性，因该菌引起的炭疽病遍及世界各地，极大地影响了社会公共卫生和经济的发展，及时、快速、灵敏地检测炭疽芽孢对预防疾病暴发具有重要意义。其次研究较多的是蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。有些蜡样芽孢杆菌会产生肠毒素，造成严重的恶心、呕吐和腹痛症状，危害消费者的身体健康。研究最少的是不具有致病性的产芽孢细胞，如嗜热脂肪地芽孢杆菌。虽然其不具有致病性，但具有很高的致腐能力，严重影响产品的货架期。

随着科学技术的不断发展，很多芽孢的快速检测方法被报道。然而这些方法均是针对某一特定菌株芽孢进行定量，或者是能够对两三种芽孢菌进行区分计数，但是仍然缺乏对总芽孢的快速计数检测方法。在未来，如果能够开发出总芽孢数的快速检测方法，不只是针对某一种菌株的致病性或致腐性进行研究，而是综合考虑微生物的致腐性和致病性，对于提高食品安全检测效率，保障消费者食用安全具有重要意义。

引文格式：

和晓兰, 郑楠, 赵艳坤, 等. 产芽孢细菌检测方法的研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(9): 391-400. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-105.

HE Xiaolan, ZHENG Nan, ZHAO Yankun, et al. Research progress in detection methods for spore-forming bacteria[J].Food Science, 2025, 46(9): 391-400. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-105.

实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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