《食品科学》：河南农业大学毛烨炫博士等：低共熔溶剂在食品中真菌毒素提取方面的研究进展

真菌毒素是丝状真菌产生的一类低分子质量次级代谢产物，其大多具有血液、肝脏、肾脏、皮肤、神经或免疫毒性，有些甚至具有致癌性，根据联合国粮食及农业组织统计，每年有25%的粮食作物受到真菌毒素污染，食品和饲料快速警报系统也报道了多起食品中真菌毒素污染事件。目前已在食品基质中发现400多种真菌毒素，各个组织和国家对不同食品基质中真菌毒素制定了严格的限量标准。

样品处理涉及分析物的提取和样品提取物的纯化。但是在提取过程中，传统方法存在步骤繁琐、消耗大量高毒有机溶剂的缺点，因此，萃取过程中常用的传统有机溶剂逐渐被新型绿色的溶剂所取代，如低共熔溶剂（DESs）。DESs是由氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBAs）以适当的物质的量比混合生成。

河南农业大学食品科学技术学院的陈梦甜、毛烨炫*及新乡医学院三全学院的杨天宝等详细综述DESs的制备方法、分类、基本特征及其在真菌毒素提取中的应用，旨在为DESs在食品中真菌毒素准确、灵敏的检测提供理论支撑。

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DESs的制备方法

DESs首次由Abbott等在2003年提出，其在研究中发现氯化胆碱（ChCl）（熔点302 ℃）与尿素（熔点133 ℃）以1∶2（物质的量比）混合生成的DESs在室温（熔点12 ℃）条件下呈现液态，具有优异的溶剂特性，至今受到越来越多的关注。DESs主要通过加热搅拌、冷冻干燥、真空蒸发以及超声辅助4种物理方法合成（图1）。加热搅拌法通过称量一定物质的量比HBDs和HBAs，混合加热并不断搅拌，直到获得一种透明、均匀的液体，是目前合成DESs的主要途径，具有溶剂用量大、使用方便、生产成本低、简单、安全等优点。但高温会引起热降解，因此选择合适的温度和时间是制备DESs的关键因素。真空蒸发通过加热、翻转或施加超声波增加溶解性，最后蒸发水分制备得到DESs。与加热搅拌方法相比，这种方法可在相对较低的温度条件下进行，适用于熔点较高的组分，但低温条件下水分的蒸发耗时耗力，不适合非水溶性化合物的制备。冷冻干燥通过在－80 ℃条件下干燥除去水分，使混合物达到恒质量而制备获得DESs。该方法较为耗时，且不适合非水溶性化合物的制备，但较低的反应温度可以防止氨基酸等热敏成分分解。与加热和真空蒸发方法相比，冷冻干燥获得的DESs纯度较高。超声辅助法通过将混合物超声加热至澄清液体后获得DESs，可以更快、更有效地合成，消耗更少的能量。

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DESSss的分类

DESs的组成可由通式Cat＋X－zY表示。其中，Cat＋代表任何铵、磷或硫离子；X代表Lewis碱，通常是卤化物阴离子，X－和Lewis或Brønsted酸Y形成阴离子络合物（z指与阴离子相互作用的Y分子的数量）。根据成分的性质，DESs可分为5种类型，如图2所示，包括I型DESs（MXn＋季铵盐）、II型DESs（MXn·mH2O＋季铵盐）、III型DESs（季铵盐＋HBDs）、IV型DESs（MXn＋HBDs）和V型DESs（中性HBAs＋HBDs）。大多数研究都集中在季铵和咪唑阳离子上，特别是ChCl(HOC2H4N＋(CH3)3Cl－)体系，如ChCl＋尿素，由于ChCl具有溶解大量物质的能力，DESs III型是最常用的萃取剂，可用于提取生物活性物质、农药兽药以及真菌毒素等。此外，V型DESs由中性HBAs和中性HBDs的混合物组成，它们之间存在着强烈的相互作用，如百里香酚＋薄荷醇。这种类型的相互作用在制备非离子型DESs中起着关键作用，也被归类为疏水低共熔溶剂（HDESs），在提取非极性化合物中具有潜在应用前景。这些DESs制备简单，与水不易发生反应，多数可生物降解，成本相对较低。DESs中HBDs种类繁多，而液体的物理性质取决于HBDs，因此可以根据目标，设计具有不同HBDs的DESs，以满足不同的提取需求。

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DESs的基本特征

DESs的物理化学性质受到广泛关注，包括凝固点、黏度、密度以及电导率等。凝固点是DESs的典型物理特征，与理论理想混合物相比，A＋B（A和B指HBAs和HBDs）二元混合物共熔成分的凝固点差异ΔTf（ΔTf指在一定的外压条件下（101.3 kPa），该物质的液相和纯物质固相的蒸汽压相等时，即固-液两相平衡共存时的温度）与A和B之间的相互作用强度呈正相关，相互作用越大，ΔTf越大，凝固点越低（图3），这主要受离子对称性、烷烃链长、氢键形成能力以及制备方法等多方面影响。凝固点低于50 ℃的DESs可以在许多方面中用作提取溶剂。另外DESs的凝固点也受到所选有机盐的影响。与传统有机溶剂相比，DESs体系的黏度较高（10～1 000 Pa·s），不利于其在商业中的应用。例如，20 ℃时，DESs的黏度为0.052 Pa·s，水的黏度为0.001 Pa·s。因此，探究DESs的流体性质对其应用尤为重要，目前研究中描述DESs流动特征的模型主要有Arrhenius模型和Vogel-Fulcher-Tammann（VFT）模型两种形式。DESs组分中丰富的氢键网络使其结构中所有物质的流动性降低，导致黏度增加。另外，DESs的黏度具有温度依赖性，HBAs和HBDs的结构对DESs的黏度有着重要影响。一般情况下，HDESs比亲水型DESs具有更低的黏度，扩展了它们的应用范围。密度是DESs的另一个关键指标，大多数DESs的密度一般高于水，而HDESs的密度通常比水低。根据空穴理论，当HBAs和HBDs混合形成DESs后，DESs的半径减小，使其比母体化合物黏度更大、密度更大，不同的DESs密度随其内部分子排列和组分的变化而变化。一般来说，DESs密度增加时，体系的摩尔自由体积减少，表明形成了新的氢键。其次，DESs的离子电导率一直是电化学应用方面的研究热点，电导率的差异取决于离子的大小和黏度，这两者都与空穴理论有关，例如可以通过减小阳离子尺寸并用氟化物代替HBDs增加DESs的自由体积，从而降低DESs的黏度并增加其离子电导率。此外，DESs还具有可调的pH值、较高的表面张力和较低的生物毒性。因此，选择不同的HBAs和HBDs组合，可制备理化性质各异的DESs，为其在样本提取的应用中提供多种可能。

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DESs在提取真菌毒素中的应用

真菌毒素是真菌产生的次生代谢物，容易污染谷物、坚果等食物。人们通过直接（如食用真菌毒素污染的谷物食品）和间接（如食用被真菌毒素污染的动物奶或肉）途径摄入真菌毒素而使健康受到危害。在这些真菌毒素中，黄曲霉毒素（AFs）、伏马毒素（FBs）、赭曲霉毒素（OT）、脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）、展青霉素（PAT）和玉米赤霉烯酮（ZEN）对全球人类健康构成最大威胁，其限量标准如表1所示。目前，食品基质中真菌毒素的提取方法主要包括液相萃取（LPE）和固相萃取（SPE）等。这些方法在使用时存在一定缺点，包括需要使用高毒性有机溶剂、提取时间长以及提取步骤复杂等。例如，在提取谷物样本中AFs时，一般称取5 g样本，加入20 mL乙腈-水（84∶16，V/V）或甲醇-水（70∶30，V/V）溶液，涡旋振荡20 min后，离心取上清液进行检测。通过上述检测方法可获得较高的回收率。上述技术在检测一些高油脂样本时，常需要采用正己烷去脂或低温冷冻去脂，才能获得较高的回收率。

近年来，DESs以其可通过调控HBAs和HBDs种类，呈现不同的极性、pH值等特点，成为新一代样品预处理的绿色替代溶剂，并得到广泛应用，为开发环境友好型、选择性高、成本低的提取方法提供了有效途径。目前，已报道了一些关于DESs在提取食品基质中真菌毒素的研究（表2），多数集中在基于DESs的提取方法与基于液相色谱或紫外-可见光谱法（UV-Vis）的联用。针对不同的真菌毒素分子结构特征，设计合成相应的DESs，以此提高真菌毒素在食品基质中的选择性和回收率。

4.1 pH值调控DESs在提取真菌毒素中的应用

目由于某些真菌毒素在酸性条件稳定性较高，通过选择具有不同酸碱性的HBAs和HBDs，可调控DESs的pH值，从而改善DESs对此类真菌毒素的提取性能。PAT是一种由曲霉和青霉等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于各种霉变水果中，其分子结构在酸性条件下非常稳定，碱性环境中容易降解。Taşpinar等以ChCl、甜菜碱和L-脯氨酸为HBAs，以L-酒石酸、乳酸、甘油和麦芽糖为HBDs，通过HBAs与HBDs不同物质的量比混合，超声加热制备获得不同酸性的DESs，用于提取果汁中PAT。结果表明，当果汁样本分别经酶处理和乙腈-水（1∶1，V/V）萃取后，2.0 mL样本提取液与410 μL DESs溶剂混合，促进PAT从有机相向DESs相转移。最终发现，ChCl＋酒石酸所形成的DESs对PAT有最高的富集因子（150），是其他萃取技术的1.5～50 倍，使用DES提取PAT有较好的提取效果；同时根据密度泛函理论计算也表明PAT与ChCl＋酒石酸具有更强的相互作用，实验结果与理论计算结果一致。

ZEN是由禾谷镰刀菌属产生的次级代谢产物，通常会污染玉米、小麦等谷物，在酸性条件下溶解度较高。因此，Elik等以甜菜碱作为HBAs，以苯乙酸作为HBDs，混合后超声加热获得酸性DESs，用于提取谷物中ZEN。结果表明，当10 g谷物样本经50 mL甲醇-水（80∶20，V/V）提取后，10 mL样本提取液经醋酸缓冲液调节pH值到3.8，与175 μL的DESs混合促进ZEN的相转移，最终获得ZEN的富集因子（157）是其他萃取技术的1.25～11.5 倍。

在上述研究中，食品样本基质经常规有机溶剂提取后，再与少量DESs混合，促进真菌毒素从有机相向DESs相转移，实现样本中真菌毒素的净化和富集，均获得了较高的富集因子。但在这些方法中，多数是在有机溶剂提取步骤后，再通过DESs净化富集步骤，在实际应用检测中，不利于简化步骤，仍然需要消耗较大量的有机溶剂，一定程度上限制了DESs在此类方法中的应用。简化样品前处理步骤是提高食品基质中真菌毒素提取效率，降低基质效应的有效手段。Zhao Luyao等采用QuEChERS技术与DESs联用，直接用于提取谷物样本中OTA（图4）。该研究中根据OTA在酸性条件下稳定，在碱性条件下易还原的特性，以乙酰丙酸作为HBAs，提供酸性环境，以葡萄糖作为HBDs，混合加热合成DESs，作为QuEChERS方法的溶剂，替代了有机提取溶剂，提取时间较常规QuEChERS方法从47 min缩短至2 min，提取效率也在85%以上。另外，通过分子对接技术，探究了DESs与OTA之间的相互作用，结果表明，DESs的HBAs和HBDs之间的结合能为－4.184 kJ/mol，而DESs与OTA分子间相互作用的结合能为－15.481 kJ/mol，说明热力学上DESs与OTA的作用是有利的。从氢键距离来看，乙酰丙酸的羧基与葡萄糖的羟基形成氢键的距离分别为2.8、2.9、3.0、3.1、3.2 Å，当OTA进入DESs的氢键网络后，OTA分子中的羰基、氨基和羧基与DESs中的羟基和羧基相互作用形成氢键的距离分别为2.74、2.78、2.88、2.89、2.91、3.21 Å，进一步说明DESs与OTA之间发生了强相互作用。

4.2 极性调控DESs在真菌毒素提取中的应用

真菌毒素种类较多，分子极性差异较大，可通过调控HBAs和HBDs的极性，实现DESs极性的精准设计，达到提取特定真菌毒素的目的。Pradanas-González等以ChCl为HBAs，通过组合不同极性的HBDs（尿素、乙二醇、丙二酸或葡萄糖），混合加热制备不同极性的DESs，用于提取食用油中的ZEN、DON和OTA 3种真菌毒素（图5A）。结果表明，当0.17 g植物油直接与0.32 mL（含16.4%水）DESs振荡混合后，ChCl＋尿素制备获得的DESs对DON和OTA具有较高的提取效率（72%～75%），对ZEN的提取效率较低（23%），这可能是因为该DESs极性较大，与DON和OTA极性相似，而与ZEN的极性相差较大。同样，以ChCl为HBAs，以尿素、乙二醇、丙二酸和葡萄糖为HBDs，混合加热合成DESs，直接用于提取可食用昆虫中的真菌毒素（图5B）。在该研究中，0.15 g昆虫粉末样本直接与1 mL DESs混合离心后，与超纯水1∶1（V/V）稀释即可上样进行检测，可同时提取5种极性相似的真菌毒素（FB1和FB2、HT-2、T-2，OTA），并且比常规有机溶剂提取效率提高了1 倍以上。结果显示，以丙二酸作为HBDs时，提取效率最低，而以尿素为HBDs合成的DESs具有最高的提取效率，表明所制备DESs的提取效率取决于HBDs的种类。

上述研究中的DESs多为亲水性提取溶剂，在极性较小的真菌毒素提取中，仍然会存在提取效率不高的问题，调控DESs的极性可能会提高真菌毒素类化合物的提取效率。Elik等为了提高提取溶剂对OTA的选择性，以肉碱、甜菜碱和百里香酚为HBAs，以不同脂肪酸（包括乙酰丙酸、己酸、癸酸和十一碳烯酸）和多元醇（包括薄荷醇和六氟异丙醇）为HBDs，通过微调DESs的极性，混合加热制备获得6种不同极性的HDESs，用于提取水果干中OTA（图6）。结果表明，以肉碱为HBAs，以六氟异丙醇为HBDs合成获得的HDESs有最高的提取效率。当10 g水果干样本经1.5 mol/L HCl溶液酸化和2.5 mL四氢呋喃提取后，将pH值调节至5.6，并与485 μL HDESs混合，促进OTA向HDESs相转移，富集因子达138，是其他基于金属有机骨架化合物（MOF）或分子印迹（MIP）萃取技术的1.4～4 倍；另外，该HDESs在其他常见化合物（包括AFB2、DON和β-胡萝卜素等）存在时，OTA的提取效率在93%以上，表明该HDESs对提取水果干中OTA具有高度选择性。同样，Pochivalov等以萜类化合物（薄荷醇和百里香酚）为HBAs，以长链醇（己醇、庚醇、辛醇和癸醇）为HBDs，通过碳链长度调控HDESs的极性，混合加热制备获得不同HDESs，用于提取谷物样本中ZEN。结果表明，癸醇的疏水性过高，极性过小，降低了DESs对ZEN的提取效率，最终选择以百里香酚为HBAs，己醇为HBDs，获得极性精确调控的HDESs。当0.5 g样本经1.5 mL DESs的乙腈溶液（50 g/L）提取后，通过加入2 mL水达到相分离，促进ZEN向萜类化合物相转移，富集因子为15.8，提取效率为93%，较常规乙腈提取效率（66%）有明显提高。另外，研究发现HDESs提取靶标分子时，有机溶剂会影响HDESs的组分比例，从而影响提取靶标的能力。在HDESs稳定性研究中，基于薄荷醇基的HDESs在不同的组分比例下与水相接触稳定，然而，乙腈提高了疏水物质在水相和DESs中的溶解度，促使HDESs的HBAs和HBDs在乙腈-水混合物中的溶解度不同，导致部分乙腈进入到HDESs相中，从而改变LPE过程中HDESs组分的比例。因此，在LPE过程中HDESs组分比例变化的影响在之后的研究中也需进一步考察。

上述研究多采用单一种类DESs提取真菌毒素，而多种DESs组合使用可能进一步提高DESs对真菌毒素的选择性。Lesan等以ChCl为HBAs，以乙二醇、二氯乙酸和苯酚为HBDs，混合加热获得DESs。同时以百里香酚和香芹酚为HBAs，以乙基甲基氯化铵为HBDs，混合加热合成HDESs，通过DESs和HDESs两相液态形式，直接用于提取大米中AFs。在该研究中，2 g大米样本直接与2mL DESs混合提取，随后向DESs相中加入90 μL的HDESs，并与5 mL去离子水混合离心，促进AFs向HDESs转移，达到富集净化的目的。该方法不使用有机溶剂，富集因子在55～66之间，提取效率比其他LPE或SPE技术增加了将近1 倍，提取过程中也明显减少了有机溶剂的使用。

SPE主要基于固体萃取剂的选择性吸附和选择性洗脱特性，实现对目标化合物的富集净化，DESs的引入可以增加SPE的选择性，从而提高靶标分子的回收率。但目前基于DESs-SPE技术在提取真菌毒素中的研究还较少。Kardani等以ChCl作为HBAs，以甘油作为HBDs，混合加热获得DESs，将其功能化于MOF表面，以稳定MOF，并与MIP结合，制备获得新型固体萃取剂（MOF-DESs@MIP），用于提取谷物中AFs（图7A）。结果表明，25 g谷物样本经100 mL甲醇-水（70∶30，V/V）溶液提取，10 mL提取液用磷酸盐缓冲液稀释5 倍，随后通过基于MOF-DESs@MIP的SPE柱，AFs则被MIP捕获，停留在SPE柱内，最后使用3 mL乙腈-水（90∶10，V/V）溶液对SPE柱进行洗脱，获得富集净化后的AFs溶液，富集因子达159，提取效率（95.3%～98.5%）也比SPE柱高。

在SPE萃取过程中，需要经过上样、清洗、洗脱等多个步骤才能实现靶标分子的富集净化，减少萃取步骤是改善SPE技术的有效途径。MSPD技术将提取和净化整合为一个步骤，提高了SPE使用效率，已应用于各种样品的预处理。Wu Yiwen等以四丁基氯化铵为HBAs，以己醇、十二醇和己酸为HBDs，混合加热制备获得3种DESs，利用MSPD萃取技术，提取小米、花生和火麻仁中AFs（图7B）。结果表明，1.0 g样本与0.5 g分散剂混合均匀后与200 μL DESs混合，随后转移到SPE柱中，经6 mL乙腈洗脱获得富集净化后的AFs，氮气吹干后，溶解于1.0 mL乙腈溶液，即可进行检测，提取效率超过97%，是无DESs存在时提取效率（～50%）的2 倍，重复性的变异系数也小于7.5%，证明了该方法的稳定性。另外，在提取小米样本中AFs时，DESs-MSPD获得的AFB1浓度是使用以N-丙基乙二胺固相吸附剂为分散剂的传统MSPD方法的8 倍。而DESs的引入也减少了有机溶剂的用量，同时缩短了提取时间。

通过合理设计HBAs和HBDs的组合，获得不同极性的DESs，可用于提取样本中不同种类的真菌毒素。同时DESs与其他技术的联用也明显减少了食品样本的前处理步骤，并且提高了各种食品基质中真菌毒素的提取效率，减少有毒有机溶剂的用量，已经在活性物质、农药和兽药等提取中得到广泛应用，但在真菌毒素提取中的研究较少。因此这些研究为进一步准确、快速检测食品中真菌毒素残留提供了重要的技术支撑。

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结 语

真菌毒素作为天然存在的有毒化学物质，广泛存在于各种食品基质中，对人类健康构成严重危害。开发简单、绿色、高效的样品预处理技术和灵敏的检测方法是保障食品安全的重要手段。已证明DESs比许多有机溶剂具有更好的提取性能，可用于分析各种样品。由于其提取真菌毒素的效率更高、提取条件温和、合成方法简单及绿色环保等特性，使其成为一种潜在的常规有机提取溶剂的替代品。本文综述了DESs的基本特征及其在食品基质中提取真菌毒素方面的最新研究成果，特别是以ChCl为HBAs的DESs溶剂。然而，DESs在提取食品真菌毒素方面的应用还处于起步阶段，需要更多的研究和探索。

1）DESs黏度的调控：DESs在提取过程中最困难的是其高黏度以及提取后溶质的分离。有些DESs在室温条件下是固体或凝胶，其黏度通常高于有机溶剂。基于DESs组分可调控性，研究人员可进一步通过改变原料种类和合成方法调整DESs的黏度。另外，也可以向提取体系中加水或提高温度，以降低黏度和增加扩散系数，从而提高提取效率，但应详细考察水的添加量对DESs性能的影响，扩大DESs在样本前处理中的应用范围。

2）DESs与真菌毒素结合能力的研究：由于DESs组分灵活易变的特点，可根据靶标分子的结构特点，设计具有特定功能的DESs，以提高样品基质中真菌毒素的提取效率，如根据OTA在酸性环境稳定而在碱性环境不稳定的特点，科研人员在DESs中引入酸性组分；根据ZEN分子极性小的特点，科研人员通过设计合成HDESs，大大提高了ZEN的提取效率。而关于DESs与真菌毒素之间相互作用的研究还较少，目前仅通过结合能和氢键距离加以解释。仍需进一步探究它们的物理/化学性质和提取机理，为DESs的应用提供有力的理论支撑。

3）DESs与多种分析方法的联用：DESs在提取样本中真菌毒素的应用多数集中在基于DESs的提取方法与基于液相色谱或UV-Vis的联用，而与其他快速检测方法（如LFA法）联用还未见相关报道。因此，进一步探究DESs与其他分析方法联用的可行性，扩大DESs在样本前处理中的应用范围，具有重要的现实意义。

引文格式：

陈梦甜, 杨天宝, 李庆越, 等. 低共熔溶剂在食品中真菌毒素提取方面的研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(7): 357-366. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-107.

CHEN Mengtian, YANG Tianbao, LI Qingyue, et al. Research progress on application of deep eutectic solvents for extraction of mycotoxins from food matrices[J]. Food Science, 2025, 46(7): 357-366. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-107.

实习编辑：闫凯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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