这种技术的出现，让我们看见了生物体内前所未见的微观世界 | 科学讲坛——巩岩

做了30年的科研工作，

我的体会就是如果你认准一个目标，

就一定要坚持做下去。

巩 岩· 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究员

格致论道第45期 | 2019年9月22日 北京

这是一个关于突破光学衍射极限，打造观测微观世界慧眼的故事。

2018年世界卫生组织公布了世界癌症患者的数量，共有1810万癌症患者，其中960万人死于癌症。我国是人口大国，每年都有很多新增癌症患者。在我国，平均每分钟就有7人被确诊为癌症患者，每5分钟就有5人死于癌症。

实际上，在我们平时说话的同时，可能已经有5个家庭永远失去了他们的亲人。这个数字非常惊人，也非常令人痛心。为什么会有这样的情况？问题到底出在哪儿？癌症的机理是什么？我们怎么去准确地诊疗癌症？怎么用药物才能有效地治疗癌症呢？

▲ 宫颈癌海拉细胞

这是一张宫颈癌海拉细胞的图片。海拉细胞实际上是研究细胞的一个“小白鼠”。这个细胞的尺度约为10微米。我们研究癌症，不仅仅要看这个细胞的轮廓，还要看到它里面的这些红丝，这些小绿点，这些代表的是细胞中蛋白质等微细的结构。

这些结构的尺度一般在10纳米左右，用常规的显微镜肯定无法看到。还有一件让全世界都很恼火的事，就是全球人口正在逐渐老龄化。随着人口老龄化的发生，老年疾病（学术名词叫神经退行性疾病）的患病人数也在大量增加。

▲ 阿尔兹海默症患者大脑

这是一个阿尔茨海默病（俗称老年痴呆症）患者的大脑图，这个大脑和正常人的大脑相比，已经严重萎缩了。现在全世界都不知道阿尔茨海默病是如何发生的，衰老为何导致阿尔茨海默病患者发生如此大的变化。

要研究这个机理，我们要看清神经元细胞，要了解它是怎样的结构，尤其更微细的结构，以及神经元细胞如何传导信号这样的一个过程。传统显微镜显然无法帮我们实现这些，所以我们就需要发明一种更高分辨率的显微镜，这就是“超高分辨荧光显微镜”。

探索微观世界的“慧眼”

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有了这个超高分辨的荧光显微镜，我们就可以看清我们从来没有见到的微观世界。

我们每个人都去过医院，都做过CT、核磁共振这样的检查。这类检查的尺度只在器官或者组织水平。它的大小通常为几微米或者几毫米，像我们的血管、肺或者骨骼。

因为我们的生物学家要看清病毒，要看清蛋白质这样尺度的微细结构。办法是有的，那就是用电子显微镜。电子显微镜和原子显微镜可以实现以上要求。

但电子显微镜和原子显微镜都有一个最大的缺点——不能进行活体细胞的观测。传统的光学显微镜显微镜可以克服这个缺点。

我们很小的时候就知道光学显微镜，然而实际上，用传统光学显微镜，我们只能看到200纳米，也就是能分辨0.2微米这样尺度的物体。

▲ 左：想要看到的，右实际看到的

光学显微系统的成像原理：一个理想的物点经过光学显微系统之后，它会形成一个弥散的斑。就好像这只小猫，如果把它比喻成一个理想的物点，那么经过显微系统后，它就变得模糊了。

一个点是模糊的，两个点经过显微系统之后依然是模糊的。像这幅图，如果两个点离得足够远，我们人眼能把它们分清。

如果两个点离得足够近，我们依然能把它们分清。那么这个时候，我们就认为它达到了一个极限的水平，就像这幅图。如果两个点离得特别近，近到我们很难把它们分清楚，那么这时的极限距离是多少？

▲ 德国科学家阿贝 （1840～1905）：“魔咒”公式

1873年，德国一位叫恩思特·阿贝的伟大科学家通过严格的理论推导，给出了这个极限距离，用公式表达就是d=λ/2nSinα。

人们为了纪念这位伟大的科学家，把这个公式刻到了他的墓碑上。

通过这个公式可以看出，如果我们在可见光波段，就是λ等于400纳米的时候，n和Sinα都等于1的时候，这个光学显微镜的极限分辨率实际上只有λ/2，也就是只有200纳米。

破解光学显微系统的分辨率魔咒

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这个公式的发明确实解开了困扰科学家们多年的一个难题。“光学显微系统能达到多少分辨率”这一难题就像魔咒一样束缚了科学家的思维。人们一直想找到办法破解这个魔咒，使显微系统能够看清更细微的物体。

▲ 威廉姆•莫尔纳（William Moerner）：美国化学家

埃里克•白兹格（Eric Betzig）：美国应用物理学家

斯蒂芬•黑尔（ Stefan Hell ）：德国物理学家

后来有三位科学家非常幸运的破解了这一魔咒。他们就是发明了荧光显微技术的三位科学家。为了纪念这三位科学家在超分辨显微系统方面所做出的贡献，2014年诺贝尔化学奖就颁给了他们，他们中有两位是美国人，一位是德国人。

为什么颁的是化学奖，而不是物理学奖？难道光学显微镜是化学问题吗？

人们都有这样一种感觉，就是我们在一个黑暗的树林里可以看到一群萤火虫在飞舞，但如果想看一只萤火虫飞舞就很难了。

▲ 荧光蛋白开关的方法

但是美国化学家莫纳做到了。在生物界，他做到让人们只看见一个荧光分子在闪亮。这是他很重要的一个贡献，因为他发明了荧光分子的开关技术。

当一束高能的光照射到荧光分子的时候，荧光分子就亮了；再用别的照射它，又可以让它熄灭，就像自己家的灯的开关一样。

这项化学技术实际上是实现光学超分辨的核心之一，所以给他颁的是诺贝尔化学奖。

▲ PLAM工作原理

受到莫纳的启发，美国的另一位科学家——白兹格，把单分子开关的技术应用到了显微系统上，发明了光激活定位显微技术，简称PALM技术。

比如左边这幅图，每次每个图都在闪烁，每次只看一个点，同时把它的位置记录下来。通过很多幅这样图像的叠加之后，我就可以看到最右边具备超分辨水平的图了。

这就好比看银河系的时候看不清，但如果每次只让一颗星闪亮，等所有星星都分别成像以后，再把它们叠加起来，就可以看清整个银河系了。

实际上白兹格是一个中国女婿。他是一个富二代，但他不想接手家族的企业，而是想追寻自己热爱的显微系统的研究。

▲ Eric Betzig在家搭建的超分辨显微镜

这张照片就是他在自己家客厅组装的PALM显微镜。他的生活正应了现在一句很流行的话：如果你不好好做科研，那么只好回家继承百万家产。

获得这次诺贝尔化学奖的还有德国科学家黑尔。他发明的技术实际上是受激发射损耗显微技术，简称STED。他和白兹格完全是两类人。他是一个屌丝，为了喜爱的显微镜事业，他需要经常到外面找科研经费。

▲ 受激发射损耗显微技术 STED

他也发明了一种独特的办法，就是用一束光去照明所有荧光分子的时候，这些荧光分子都会被点亮。这时候，用另一束像“甜甜面包圈”一样的光，去熄灭这些荧光分子周围的光，那么就会只剩下中间一点纳米量级的分子的光，如此，我们就实现了超分辨。

受这两位大师的启发，现在的科学家也发明了很多其他的显微系统。像干涉定位显微系统，像结构光照明显微系统。这些系统都为科学界，为生物细胞研究，做出了巨大的贡献。

获得诺贝尔奖的科学家都非常聪明，而比他们更聪明的是一些商人。

▲ 显微镜垄断：四大百年老店

他们的技术获奖了之后，世界四大显微镜生产企业——德国的蔡司、莱卡，日本的尼康、奥林巴斯，就把他们的技术买断，然后将其变成了商品化的仪器。

现在全世界显微镜市场基本被这四家公司垄断了。这四家公司都是百年公司，他们具有悠久的历史。

中国显微镜现状

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而我们中国的显微镜现状又是怎么样的呢？

中国的显微镜历史并不短，有70年。中国第一家显微镜工厂是1943年在重庆成立的，后来搬到了江苏南京，叫江南光仪厂。

这张图是江南光仪厂当时建厂时的照片。

这张是他们的厂房。

我国第一台显微镜诞生于1953年，我们利用东德蔡司（“二战”时，蔡司公司分成了西德和东德两家）的图纸造出来了我国第一台显微镜。但是，现在我国只能生产中、低端的显微系统，高端显微系统及其核心部件完全依靠进口。

中国高端显微系统虽然发展历史不长，但我们绝不缺乏有世界眼光的科学家。2012年，中国科学院苏州医工所的所长唐玉国就率领团队开展了超分辨核心部件和系统的研究工作。

我是2014年有幸加入到这个团队的，我在这个团队里主要负责显微物镜的研发。显微物镜是显微系统的一个核心部件，也可以说是最重要的部件。为什么呢？因为显微物镜的数值孔径，就是刚才阿贝公式下面那个nSinα，决定了整个显微系统的物理分辨率。

这是我们研发的一个具有世界水平的物镜。它的视场可以达到6毫米，分辨率可以到0.5微米，可用于我们脑神经细胞、神经区域的拍摄。因为海马区很大，我们要看清楚的话，必须用这种大视场的物镜系统去研究。

这个物镜可以用于基因测序。

这张图实际上是我国第一支NA1.45高数值孔径显微镜。它就是我们超分辨系统用的最多的一个物镜。这个物镜虽然只有40毫米长，但内部结构非常复杂。

▲ 光机设计 光机加工 装配集成 像质检验 物镜封装

这张图就是它的一个剖视图。在40毫米长的范围内，有大约十几片到二十几片的小光学元件，其中有的小光学元件只有米粒般大小。

这个系统研制起来也非常艰难。除了光学材料、加工、镀膜，最难的地方就是把所有的光学件和机械件集成起来。

因为我国目前还缺乏物镜集成这方面的人才，我们的团队更缺乏有经验的科研人员。后来，我们在全国所有的光学公司寻找这样的人，终于在南京找到了一位老工人师傅，他有18年的物镜装配经验。我们把他请到实验室，经过一年的反复摸索，终于装出了中国第一支NA1.45的显微物镜。

但是高兴没有多久，我们又犯了难。因为老师傅装配物镜只能靠他的经验，靠他的手感，我们不能复制，也不能保证所有物镜的质量和效率都很好。为此，我们科研人员不得不一头扎进了实验室，研发物镜装配的一体化系统。

现在我们已经在这方面完全取得了突破，我们有自己标准化的、数字化的装配流程和工艺。在物镜研发过程当中，团队成员经常加班，经常点外卖。

有时候外卖点的太多，外卖小哥送不过来，饭店老板就直接送过来了。所以我们研发物镜不仅把中国的科研事业提到了一定的程度，打破了国外的垄断，还带动了餐饮行业的发展。

▲ 双光子-STED显微镜

令我印象最深刻的是研发这种双光子-STED显微系统，这是我国首创的显微系统。它的研发难点主要在三激光合束。也就是要求三束激光的偏移误差不能超过10纳米。

这相当于三艘宇宙飞船在浩渺的空间进行准确对接。为了攻克这个难关，科研人员一头扎进了暗室，不分白天黑夜地去做。有时候实验结束，拉开窗帘的时候，发现外边比屋里还要黑，因为已经是半夜了。

▲ 四光束三维超分辨成像

我们不仅做了核心物件，搭建了系统，同时还研发了具有自主知识产权的产品。这是我们研发的一款四光束干涉的三维超分辨显微系统。

这套系统的用处很多，可以做活细胞成像，可以做药物研发。这样的一台设备，国外同类的产品要卖到500万元人民币，而我们的售价只有国外的三分之一。

▲ 人体上皮细胞三维成像

这张图就是这套系统拍摄的人体上皮细胞的三维图，这是这套系统拍摄的肝癌活细胞在肝癌靶向药物的作用下被杀死的过程。

▲ 靶向药物作用肝癌细胞

蓝色的是细胞核，外边一圈粉色的是细胞膜外包裹的药物。这个药物进入到细胞里，然后把细胞杀死了。

有了这样的系统，我们很高兴，因为它可以加速我国肝癌靶向药物的研发进度，让更多的癌症患者得到及时的治疗和康复。

我很自豪，因为我们医工所不仅做了核心部件，研发了系统，最重要的是，我们搭建了一个高精度超分辨显微系统的研发平台，这个平台可以让中国的生物学家、科学家定制自己的产品，做出世界领先的科研成果。同时我们的系统也卖到了美国、日本、以色列以及德国。

超分辨显微系统的应用

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超分辨显微系统虽然诞生只有二十几年，但是它在各方面起到的作用都是非常大的。尤其在分子生物学和细胞生物学上，可以说是引起了革命性的变化。

▲ 传统光学显微镜

展示一下超分辨显微系统的魅力。这张图是小白鼠大脑海马区的一个超分辨显微系统的观测图。这是常规系统拍摄的图，实际一片模模糊糊。

▲ STORM

这是用超分辨显微系统拍摄的同区域的图，逐级放大很多之后，图像依然很清晰。这张图是用于阿尔茨海默病的研究的。

▲ SIM记录的海马神经元丝状伪足的运动

这也是一张用超分辨显微系统拍摄的海马区神经元丝状伪足运动的图像。这种图片可以让我们知道人体是如何感受外边的刺激，如何传导信号的。

▲ 人体直肠癌组织切片

这是人体直肠癌组织切片的照片。左边是共聚焦的图，它最多只有200～300纳米；右边是它的囊泡里面蛋白质分布的照片。它非常清楚。通过右边的这些照片，我们的科学家可以进一步阐述癌症的发病机理。

▲ 人体宫颈癌细胞

这是人体宫颈癌细胞的一个图片，细胞里不同的分子，不同的物质都能够分得很清楚，这对我们的科研有着很重要的意义。

▲ 小鼠大脑神经元树突

这是一个小鼠大脑神经元的树突，也可以看清我们人体是如何思考，如何在放电。

做了30年的科研工作，我的体会就是如果你认准一个目标，就一定要坚持做下去。

这就像刚才说到的那位美国科学家，他不去接手家族企业，而是坚持做自己热爱的研究，最终成为了一名诺贝尔奖获得者。正是因为他一直坚持超分辨显微系统的研发，最终他才取得了成功。

另外，我们科研工作者有一个梦想，那就是让我们的产品真正走向世界，让全世界都用上我们中国制造的超分辨显微系统。让全世界的科学家找到癌症的发病机理，找到阿尔茨海默病的发病机理，研制出更多更好的药物，服务于我们的健康。

文章转载自“格致论道讲坛”微信公众号