Mol Ther丨高雪团队报道工程化A3G5.13 BE的开发成果

单核苷酸变异（SNVs）是人类遗传性疾病的主要成因之一。目前， ClinVar 数据库已注释的致病性SNVs数量超过66,000个。这些致病性变异中，有相当大一部分原则上可以通过精确的C·G到T·A碱基对转换进行建模或修正。能够在不产生DNA双链断裂的情况下实现此类转换的胞嘧啶 碱基编辑器 （CBEs），为相关研究和治疗提供了重要工具。然而，传统CBEs的实际应用受到两方面的显著制约：其一是在胞嘧啶富集序列中容易引发非预期突变的旁观者编辑效应；其二是其所依赖的SpCas9蛋白对NGG原间隔区相邻基序（PAM）的严格要求。这两个因素共同限制了编辑的精确度和可靶向的序列范围。尽管近期开发的基于APOBEC3G的编辑器A3G5.13 BE 展现出对C C 基序中第二个胞嘧啶的高度选择性，但该编辑器仍存在明显局限：在单次编辑窗口内会对多个胞嘧啶产生残余编辑，并且完全依赖于NGG PAM序列。这些特性使得在众多临床相关位点实现精准编辑面临挑战，因此需要进一步的工程化改造。

宾夕法尼亚大学高雪团队近期 在MolecularTherapy杂志上发表了题为：Precision A3G Base Editors for Disease Modeling and Correction的文章 报道了工程化A3G5.13 BE 的开发成果。该团队通过三个关键改进实现了其对单个胞嘧啶精确编辑的性能提升：优化连接子设计、实施靶向理性脱氨酶突变，以及整合PAM识别范围更广的SpG和SpRYCas9变体。这些改进显著提升了单碱基编辑精度，同时大幅扩展了可靶向的基因组位点。为了验证该技术在疾病相关场景中的实际应用价值，研究者选择将其应用于囊性纤维化（ C ys tic f ibrosis ）。这是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因致病变异引起的严重单基因疾病。工程化变体包括A3G5.13P 、 A3G5.13P-E和A3G5.13P-KE，这些变体在HEK293T细胞中成功实现了对CFTR相关SNVs的精准引入与校 正并 显著降低了全基因组范围内的旁观者编辑及其他形式的脱靶编辑。在生理相关性更高的人支气管上皮细胞（ 16HBE14o − ）中，研究团队进一步验证了 该工程化A3G5.13 BE 及其变体的 治疗效果。 CFTR 突变的治疗性校正成功挽救了疾病的典型特征 ，使 CFTR 蛋白表达和氯离子通道功能都得到了恢复。

该研究首先通过改造连接A3G脱氨酶与SpCas9切口酶的连接子，减少 了 靶向胞嘧啶附近C C 基序的非预期编辑。研究者将原有的柔性XTEN连接子缩短并刚性化，改为基于脯氨酸-丙氨酸（PA）的连接子，从而限制了过度的底物结合，显著收窄了编辑窗口，同时保留了靶向C-to-T转换活性。同时，研究通过将A3G脱氨酶中带正电荷的精氨酸残基理性突变为正电荷较弱的赖氨酸或带负电荷的谷氨酸，降低了其过强的DNA结合亲和力，在维持靶标胞嘧啶催化活性的前提下，进一步减少了旁观者编辑。

研究以囊性纤维化这一临床需求迫切的典型单基因疾病为模型，首先评估了工程化A3G5.13 BE 在基因组中引入致病性CFTR SNVs以模拟疾病的能力。通过将PAM识别范围更广的 SpG 和 SpRY Cas9变体整合到A3G5.13 BE 框架中，这些变体能够在原先受NGG限制的SpCas9无法编辑的位点（包括具有复杂 C C 基序结构的位点）成功引入致病性CFTR SNV，同时保持高产物纯度并最大程度减少非预期编辑。

在论文后续部分，为建立完整的疾病建模与校正流程，研究者采用了一种序贯策略：先利用腺嘌呤 碱基编辑器 （ABE）引入致病性CFTR突变，再通过工程化A3G5.13 BE及其变体 进行校正。该策略在HEK293T细胞中实现了对CFTR基因的高保真校正，与原始A3G5.13 BE 相比，显著降低了旁观者突变的数量。

研究者在生理相关的人支气管上皮细胞 16HBE14o − （该细胞天然表达 CFTR 蛋白）中 使用 了 已在 HEK293T 细胞的编辑实验中得到验证 的 引导 RN A 来 评估编辑引起的功能 性 变化。研究首先使用 ABE 引入致病性 CFTR 无义及错义突变，随后利用工程化 A3G5.13 BE 与 整合了 SpCas9 及 PAM 识别范围更广的 SpG 或 SpRY Cas9 变体进行校正。 研究表明， 与疾病相关表型一致 ， 致病突变的引入导致 了 CFTR 蛋白表达与氯离子通道活性显著下降。通过荧光成像板读取仪（ FLIPR ）膜电位检测评估 CFTR 功能， 研究 证实 了 致病突变引入后 氯离子通道 功能严重受损。重要的是，使用优化的A3G5.13变体进行校正后，CFTR蛋白表达及氯离子通道功能恢复至接近野生型水平，且旁观者编辑极少，为疾病治疗提供了有力的概念验证。

总体而言，本研究建立了一个多层次蛋白质工程框架，通过整合连接子优化、靶向脱氨酶突变及改良的PAM识别灵活性，成功构建出具有治疗潜力的高精度、广靶向性A3G5.13 BE 变体。这些发现不仅凸显了工程化A3G5.13编辑器在精准疾病建模与功能性基因校正中的应用价值，也为开发针对囊性纤维化及其他遗传性疾病的新一代碱基编辑疗法指明了前景广阔的策略方向。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2026.01.003

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