Cell Stem Cell︱可调分化：干细胞量产CD4+ T细胞

撰文 |咸姐

T细胞免疫疗法在癌症、自身免疫病和感染性疾病治疗中展现出革命性潜力，但当前主流的自体T细胞疗法面临着生产成本高昂、制备周期长、质量控制困难等严峻挑战。开发"现货型"异体T细胞产品已成为领域内的核心目标。人类多能干细胞（PSC）因其具有无限扩增能力、易于基因编辑以及可定向分化为功能性T细胞的特性，被认为是生产异体T细胞的理想来源。然而，尽管 利用PSC体外生产CD8 ⁺ 细胞毒性T细胞已取得显著进展，但CD4 ⁺ T细胞的体外诱导分化效率一直很低，尤其是无饲养层、无血清的标准化培养体系，这极大地限制了能够协同增强抗肿瘤免疫应答的辅助性T细胞在治疗中的应用。CD4 ⁺ T细胞不仅是免疫系统的“指挥官”，通过分化为Th1、Th2、Th17等不同亚型来协调并调节广泛的免疫反应，而且在以CAR-T为代表的工程化T细胞疗法中，对CD8 ⁺ T细胞的长期存活、功能维持及最终疗效都至关重要【1,2】。因此，建立一个能够可控、稳定地从PSC生产功能性CD4 ⁺ T细胞的技术平台，对于开发更有效、更低成本的通用型细胞免疫疗法具有重大的科学意义与应用前景。

为此，近日，来自加拿大 英属哥伦比亚大学的Peter W. Zandstra团队在Cell Stem Cell上在线发表题为Tunable differentiation of human CD4+ and CD8+ T cells from pluripotent stem cells的文章，解决了利用人PSC体外高效生产功能性CD4⁺辅助T细胞的关键难题。研究发现，Notch信号通路是抑制CD4⁺T细胞分化的主要障碍，而T细胞受体（TCR）信号的强度与持续时间也共同影响细胞命运。通过精确调控Notch和TCR信号，研究首次在无饲养层、无血清的体系中，成功实现了对CD4⁺和CD8⁺T细胞分化的定向、可调控诱导，为开发低成本、可大规模生产的“现货型”工程化T细胞疗法奠定了关键基础。

从PSC体外生产T细胞是一个多阶段、耗时约6至8周的过程，它模拟了体内T细胞发育的关键环节。鉴于TCR信号强度与持续时间是决定CD4 ⁺ 与CD8 ⁺ T细胞定向分化的关键因素，本文研究人员首先利用iPS11诱导多能干细胞系（ALSTEM）检测了不同强度的TCR刺激对CD4 ⁺ T细胞分化的影响。出人意料的是，高强度的刺激并未如预期般增加CD4 ⁺ 细胞，反而更倾向于产生CD8 ⁺ 细胞，仅在中低强度刺激下才能观察到少量CD4 ⁺ 细胞的诞生。这一现象提示，除了TCR信号，可能还有其他关键因子在起作用。

为此，Notch信号通路作为T细胞发育的关键调控因子进入研究人员的视线。通过 采用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch通路，并比较不同Notch配体（DLL4、DLL1、JAG1、JAG2）的作用效果，Notch信号激活（尤其使用强配体DLL4）会显著抑制CD4 ⁺ T细胞的产生，并促进CD8 ⁺ T细胞分化；而抑制Notch信号后，CD4 ⁺ T细胞比例和产量均显著提升。由此表明，Notch信号在体外系统中扮演着压制CD4谱系的角色，其“强度”直接决定了CD8谱系的偏向程度，其中DLL4的作用最强。

为了探索上述“偏心”现象背后的原因，研究人员动态监测了不同Notch与TCR信号组合条件下，iPSC来源双阳性T细胞在向单阳性分化过程中关键信号分子的磷酸化水平及谱系转录因子（ThPOK、RUNX3）的表达变化。研究发现，Notch信号（尤其是DLL4）的激活会显著抑制TCR诱导的Erk1/2和NF-κB磷酸化，并几乎完全阻断ThPOK的表达，而同时允许甚至增强RUNX3的早期表达。这种对TCR信号输出和ThPOK的特异性压制，破坏了正常的谱系竞争平衡，使得RUNX3主导的CD8谱系程序得以胜出，最终导致细胞命运系统性偏向CD8 ⁺ T细胞（图1）。

图1

基于以上发现，研究人员系统性地改变了Notch信号强度（通过调节DLL4配体浓度或使用抑制剂DAPT）和TCR刺激方式与强度（包括使用抗CD2/3/28抗体、植物血凝素PHA以及直接激活下游通路的PMA/离子霉素），并对分化结果进行量化分析，发现Notch信号的减弱和特定强度（非最高）的TCR刺激共同倾向于诱导CD4 ⁺ T细胞；反之，强Notch信号与高强度TCR刺激则促进CD8 ⁺ T细胞产生。通过优化这两个参数的组合，可以在单次培养中实现CD4 ⁺ 与CD8 ⁺ T细胞比例从高度偏向一方到近乎平衡的广泛、可预测的调控，从而建立了一个可定制化输出T细胞亚型比例的体外分化平台。

进一步地，研究人员对初始T细胞标志物以及决定谱系命运的转录因子ThPOK（CD4）和RUNX3（CD8）的表达情况进行了研究，以深入评估上述建立的PSC来源CD4 ⁺ T细胞的诱导方案。实验结果显示，这些细胞在优化条件下高表达CD4谱系关键转录因子ThPOK，同时上调成熟T细胞标志物CD27、CD62L和CCR7，并能从CD45RO表型逐渐转换为更初始的CD45RA表型。分选纯化后进行体外扩增实验则表明，细胞在IL-2存在下可增殖约15倍，并能在扩增过程中稳定维持其CD4 ⁺ 表型。此外，这些细胞在TCR再刺激后能有效上调CD71、4-1BB、OX40和CD40L等激活与共刺激分子，其表达水平与胸腺来源的CD4 ⁺ T细胞相近。这些结果表明，iPSC来源的CD4 ⁺ T细胞具备与原发性T细胞类似的成熟表型、体外增殖能力和激活特性，符合功能性辅助T细胞的基本标准。

随后，研究人员 对经诱导分化并扩增后的iPSC-T细胞进行了CITE-seq（同时检测表面蛋白和转录组）及单细胞TCR测序，分析显示，基于表面蛋白CD4和CD8表达分选的细胞群，其转录组特征与预期完全匹配。CD4 ⁺ 细胞高表达CD4谱系特征基因（如IL7R, LEF1 ），而CD8 ⁺ 细胞则高表达CD8谱系及细胞毒性相关基因（如GZMB , PRF1 ）。此外，两种细胞均呈现出从初始/记忆态到效应/衰竭态等连续且多样化的功能状态，其中CD4 ⁺ 细胞更多富集于初始/记忆相关基因，而CD8 ⁺ 细胞则表现出更强的效应功能和部分NK样特征。由此表明体外诱导产生的iPSC-T细胞在分子水平上成功重现了天然CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞的核心谱系特征与功能异质性。与此同时，研究人员还发现，iPSC来源的CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞均能产生具有多样性的TCR克隆，尽管其总体多样性低于体内来源的原代细胞。这些TCR在V(D)J片段的使用上表现出独特的偏好模式，形成了iPSC-T细胞特有的重排特征，且iPSC-CD4 + 和CD8 + T细胞之间存在显著偏差。由此证实，体外分化系统能够支持功能性TCR的重排与选择，从而产生具有克隆多样性的T细胞。更重要的是，iPSC来源的CD4 ⁺ T细胞具备分化为功能不同的辅助性T细胞亚群的能力，iPSC-CD4 ⁺ T细胞能够响应相应的极化信号，在Th1条件下上调T-bet和IFN-γ，在Th2条件下上调GATA-3，在Th17条件下上调RORγt、CCR6并产生IL-17A/F。其极化模式与胸腺来源的CD4 ⁺ T细胞更为相似，虽然在特定因子（如IFN-γ的抑制）的调控精度上不及成人外周血T细胞，但已明确展现出向不同功能性Th亚群分化的核心潜能。

综上所述，本研究通过精细调控Notch与TCR信号，首次在无血清、无饲养层条件下实现了从人PSC到功能性CD4⁺和CD8⁺T细胞的可控分化。研究不仅揭示了Notch信号抑制CD4谱系、促进CD8谱系的分子机制，更成功获得具备多样TCR库、可体外扩增、并能分化为Th1/Th2/Th17亚群的干细胞来源CD4 ⁺ T细胞。这项突破为构建可定制化T细胞亚型比例的“现货型”细胞治疗产品奠定了关键技术与科学基础，标志着干细胞免疫疗法向更成熟、更精准应用迈出了决定性一步。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.12.010

制版人： 十一

参考文献

1. Michaels, Y.S., Durland, L.J., and Zandstra, P.W. (2023). Engineering T Cell Development for the Next Generation of Stem Cell-Derived Immunotherapies.GEN Biotechnol.2, 106–119.

2. Singer, A., Adoro, S., and Park, J.H. (2008). Lineage fate and intense debate: Myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.Nat. Rev. Immunol. 8, 788–801.

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