当CycloneSEQ遇上ONT：香港城市大学李润生团队发表纳米孔DNA测序平台性能比较研究成果

近期，香港城市大学李润生团队在

bioRxiv

核心结论显示：

• CycloneSEQ的测序数据Modal值达97.7%（Q16.4），经短读长校正后组装完整性接近100%，并能识别12种细菌甲基化基序。
  

• 研究指出，在关键性能指标上，CycloneSEQ已展现出与ONT相当的能力。

DOI:10.64898/2026.01.14.699587

纳米孔测序技术发展现状

纳米孔测序凭借其长读长、实时测序、直接检测表观遗传修饰等独特优势，在病原体快速鉴定、基因组完成图构建、耐药基因追踪等场景中展现出重要价值。长期以来，该领域由ONT主导。CycloneSEQ平台的出现，被视为中国在纳米孔测序领域实现自主知识产权的重要进展。

该研究是首个系统性、多维度比较CycloneSEQ与ONT平台性能的独立评估工作，既验证了CycloneSEQ平台的技术可行性，也为其在实际应用中的定位与发展提供了客观依据。

图：项目设计概览。

核心性能分析

reads准确率：

CycloneSEQ CS2实现显著提升

数据表现：

CycloneSEQ CS2：平均观测准确率96.0%（Q14.0），Modal值97.7%（Q16.4）

ONT R10.4.1：平均观测准确率96.8%（Q14.9），Modal 值99.0%（Q20）

差距变化：与CS1版本相比，CS2将平均准确率差距缩小至0.8%。

技术解读：

这一进步得益于CycloneSEQ平台的文库制备和碱基识别算法的协同优化。研究指出，CycloneSEQ CS2的估计准确率与观测准确率之间的差距已收窄至0.39%，表明其碱基质量值（Q-score）校准更为可靠。这有助于在数据分析中更准确地依据原始Q值进行过滤。

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同聚物区域性能：

超越R9.4.1，逼近R10.4.1

关键发现：

同聚物（Homopolymer）区域的准确测序是纳米孔技术的一大挑战。研究表明CycloneSEQ CS2在A/T和G/C同聚物的识别准确性上表现优于ONT R9.4.1，接近R10.4.1水平。这对于精准解析细菌的相变基因、毒力岛等富含重复序列的区域具有重要的实际意义。

图：纳米孔测序平台之间的读段质量比较。

基因组组装性能：

从"原始数据"到"完成图"的完整路径

原始长读长组装的挑战与解决方案

原始读长组装挑战：

CycloneSEQ原始读长的插入/缺失（InDel）错误率高于ONT，导致未校正前每100 kbp存在超过4个InDel。不过，通过结合约50倍覆盖度的长读长与短读长校正，可显著改善组装质量，获得近乎完整的细菌基因组。

校正后表现优异：

采用50×覆盖度结合短读长校正后：

组装完整性：提升至近100%（细菌染色体回收率>99.9%）

BUSCO评估：稳定在97%完整性分数

InDel密度：降至每100 kbp约1个，与ONT校正后水平相当

操作建议：

标准流程：推荐采用"CycloneSEQ长读长+ 短读长混合组装"策略。

成本控制：相较于纯ONT R10.4.1测序，CycloneSEQ在试剂成本上具有潜在优势，可将节省的资金投入短读长校正。

图：纳米孔测序平台的组装质量表现。

覆盖度优化策略

研究发现：

组装完整性在50×覆盖度后呈现边际效益递减，80×覆盖度下各平台（R9.4.1, R10.4.1, CS1, CS2）的BUSCO分数无显著差异。这为制定经济高效的测序方案提供了直接依据。

图：纳米孔测序平台的组装质量表现。

推荐方案：

常规菌株鉴定：30-50×覆盖度

高质量完成图：50-80×覆盖度 + 短读长polishing

复杂重复区域解析：可适当提高至100×

表观基因组学应用：

甲基化检测的独特优势

检测能力与灵敏度

核心发现：

研究团队成功利用CycloneSEQ reads中存在的链特异性错误，从头发现了12种细菌DNA甲基化motifs（methylation motifs），包括：

• 常见的GATC（Dam甲基化）、CCWGG（Dcm甲基化）

• 罕见的CTGCAG、GCGC等motifs

• 潜在的新甲基化 motifs 发现能力

技术机制：

与ONT类似，甲基化碱基在纳米孔中产生的电流信号偏移导致碱基识别错误，通过比较正负链的测序错误模式，可高灵敏度定位甲基化位点。这证明了CycloneSEQ平台在无需额外实验处理的情况下，直接检测6mA、4mC等细菌常见甲基化修饰的能力。研究团队还为此开发了适配CycloneSEQ信号的分析流程，为表观基因组学研究打开了大门。

与ONT的性能对比

CycloneSEQ表现亮点：

motifs覆盖广度：在部分菌株中识别出ONT未检测到的甲基化模式。

信号特征：独特的错误谱可能为新型表观遗传标记的发现提供线索。

待改进：

CCWGG过拟合：CycloneSEQ碱基识别模型在该motifs上存在系统性偏差，导致假阳性率升高，需设置更严格的过滤阈值。

图：CycloneSEQ 平台检测到显著电流信号差异。

CycloneSEQ技术优势与改进方向

当前优势：

快速迭代能力：CycloneSEQ在数月内完成从CS1到CS2的更新，实现关键性能大幅提升。

成本效益：“50倍覆盖度+短读长校正”方案兼具质量与经济性。

待改进方面：

InDel错误率：研究指出单碱基插入缺失是CycloneSEQ reads中最主要的错误类型，这也是影响无需校正的组装质量的核心因素。

特定序列的过拟合：在甲基化motifs CCWGG上，模型在无甲基化的WGA数据中产生了异常高的错误信号，表明基础模型存在对训练数据的过拟合。

Q值校准精度：CycloneSEQ CS1版本存在估计准确率高于观测准确率的情况，CS2虽已改善，但校准精度仍有提升空间。

技术演进：

CycloneSEQ S1体系展望

据悉，CycloneSEQ即将推出S1体系，涵盖试剂、算法与软件多方面的升级：

1

试剂与化学优化：“精进”测序试剂盒（S1 体系）

准确率提升：通过优化马达蛋白与生化体系的协同作用，旨在将单碱基InDel错误率控制在更低的水平，原始测序准确率可达Q20以上。

增强的稳定性：改进的缓冲体系可提供更稳定的测序环境，显著提升有效数据产出率。

2

算法与软件升级：“精进”碱基识别器

抗过拟合模型：采用更大规模、更多样化的训练数据集（包括更多种属的WGS与WGA数据），重点解决如CCWGG等特定motifs的过拟合问题，提升模型泛化能力。

Q值校准：实现更精细的Q值校准，使质量分数能更真实地反映每个碱基的识别置信度。

同聚物优化：针对G/C同聚物识别准确率相对较低的问题，进行专项模型优化。

3

分析生态扩展：“拓展”分析套件（CycloneFlow）

通过集成自主开发的专用生信工具集，全面赋能长读长数据分析。该套件核心包括：长读长序列条码拆分工具Citrus、长读长测序修饰检测数据分析工具 Poremod、长读长序列质控分析工具Rosa等。

未来展望

该研究是对CycloneSEQ技术路线的一次系统性验证，也是中国纳米孔测序产业化进程中的重要里程碑。尽管在原始读长准确率与生态系统成熟度方面仍有提升空间，但CycloneSEQ在组装后质量、表观遗传学应用与成本控制方面已展现出差异化竞争力。

从CycloneSEQ CS1到CS2（S0）的快速迭代，体现了华大序风团队的技术执行力；即将到来的S1体系，则进一步彰显了CycloneSEQ平台在性能优化与用户需求响应上的持续投入。CycloneSEQ有望为全球科研工作者，提供一个高性能、高性价比且自主可控的纳米孔测序选择，推动生命科学研究的深入发展。

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