如何筛选大肠杆菌发酵培养基以提高重组蛋白产量

导读：重组蛋白类生物制品，涵盖人用或动物用的治疗性和预防性生物制品，具体包括重组亚单位疫苗、重组VLP疫苗、纳米抗体、多肽激素、细胞因子、生长因子、治疗用酶、抗体片段等。重组蛋白的工业化发展进程与表达宿主的研发和优化息息相关。自20世纪90年代，大肠杆菌的完整基因组序列完成分析，经遗传改造后逐步发展为最常见的重组蛋白生产用宿主。全球首款重组胰岛素Humulin即通过大肠杆菌生产制备。

发酵产物的产量直接影响生产成本。随着新药开发成本的不断增加，在重组蛋白制品开发的早期阶段，发酵液蛋白产量这一指标越来越受开发者的关注。今天的文章菌菌将聚焦于大肠杆菌发酵培养基筛选和优化，结合实际案例简述其对工程化大肠杆菌生长和重组蛋白产量的影响。

一、大肠杆菌培养基成分

大肠杆菌发酵培养基对大肠杆菌的生长和重组蛋白表达量的影响至关重要。适用于大肠杆菌发酵的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等，不同营养成分发挥的作用如下：

碳源的作用是构成细胞物质的骨架、提供细胞生理活动所需的能量。大肠杆菌发酵培养基中常用的碳源包括酵母粉、葡萄糖、甘油、乳糖。其中酵母粉不仅作为碳源，还可作为氮源和磷酸盐。葡萄糖是速效碳源，但是易产生乙酸；甘油为迟效碳源，不易产生乙酸，是葡萄糖的有效替代。乳糖除作为碳源外，还能够起到诱导剂的作用，但当培养基中同时存在葡萄糖时，大肠杆菌会优先消耗葡萄糖。

氮源的作用是提供细胞原生质和其他结构物质中的氮元素。大肠杆菌发酵培养基中常用的氮素包括有机氮源（蛋白胨）和无机氮源（铵盐、硝酸盐）。在重组蛋白疫苗/药物生产工艺中，建议使用大豆蛋白胨（植物源）、或酵母蛋白胨（微生物源）代替胰蛋白胨（动物源）。基于丰富的重组蛋白开发及生产经验，耀海生物形成了丰富的无动物源培养基配方。我们能够实现培养基配方的快速筛选，实现目标蛋白产量和占比的大幅提升。

无机盐的作用包括维持pH和渗透压，并参与细胞膜、核酸的合成。大肠杆菌发酵培养基中常用的无机盐包括氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。

二、大肠杆菌发酵培养基种类

LB培养基（luria broth）制作简单，是培养大肠杆菌最常用的培养基。然而，LB碳源和二价阳离子含量降低，因此无法满足工业化生产中的大肠杆菌高密度发酵。而TB、2YT、SOB、SOC及其改良培养基组分更丰富，结合补料分批发酵工艺能够实现大肠杆菌的高密度发酵、以及重组蛋白的高水平表达。

在TB、2YT、SOB、SOC、M9培养基的基础上，耀海团队对其组分进行了细致优化，建立了丰富的培养基配方库和原料库，适用于不同特性和不同表达形式的重组蛋白。

三、案例分享

客户的目标蛋白是一种重组人生长因子，在大肠杆菌胞内以可溶性形式表达。客户初始工艺下菌体密度OD600在60~70，目的蛋白表达量为1g/L。该产量较低导致GMP生产成本高、周期长。因此，客户委托我们进行工艺开发，以提高发酵液中蛋白产量。

耀海生物凭借多年的重组蛋白表达经验积累，快速完成了发酵培养基筛选和工艺优化，菌体密度提高了2倍，可溶性蛋白产量的涨幅超过4倍，亲和色谱捕获后的蛋白产量达到5 g/L ~5.5 g/L。经下游纯化后，目标蛋白收率大幅提升，纯度和杂质残留均符合质量标准。

图示：耀海团队通过发酵培养基筛选和优化有效提高目的蛋白表达量

参考文献

[1] Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014 Apr 17;5:172. doi: 10.3389/fmicb.2014.00172.

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