J Ethnopharmacol I 他克莫司肾毒性如何破解？

2026年1月13日，海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院（上海长征医院）药学部陈万生、陶霞、张凤教授团队在Journal of Ethnopharmacology (IF=5.4，中科院2区，Q1)在线发表题为“Integrated metabolomics and proteomics analysis elucidated the therapeutic effect of Huangkui Capsule on tacrolimus-induced chronic nephrotoxicity in rats”（整合代谢组学和蛋白质组学分析阐明了黄葵胶囊对大鼠他克莫司诱导的慢性肾毒性的治疗作用）的研究论文。

海军军医大学（第二军医大学）长征医院药学部庞涛主管药师、博士研究生唐婷婷、硕士研究生王业健为本论文共同第一作者。

亮点：

•HK 可减轻体内他克莫司引起的慢性肾毒性和体外他克莫司引起的细胞毒性。

•HK 通过激活 xCT/Gpx4 通路抑制铁死亡，从而对抗 TCN。

•来自HK的槲皮素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷和柽柳素可通过上调Slc7a11/Slc3a2系统来增强GSH合成并抑制脂质过氧化。

民族药理学相关性

黄葵胶囊（HK）在治疗慢性肾脏病方面已显示出显著疗效。既往研究表明，HK可以减轻肾脏损伤；然而，HK对他克莫司诱导的慢性肾毒性（TCN）的治疗作用及其潜在的分子机制尚不明确。

研究目的

评价HK在缓解TCN方面的有效性，并探索其潜在的作用机制。

材料与方法

本研究采用生化指标和组织病理学检查，在TCN大鼠模型上评价了HK的治疗效果。通过整合肾脏代谢组学和蛋白质组学分析，揭示了TCN相关的独特失调通路和潜在靶点，并深入探讨了靶点与HK活性成分之间的关系。此外，还利用分子对接和Western blot分析对结果进行了验证。

结果

TCN大鼠表现出蛋白尿增加和肾功能恶化，并伴有炎症和氧化应激增强，而HK则以剂量依赖的方式改善肾损伤。整合代谢组学和蛋白质组学分析表明，HK通过恢复谷胱甘肽代谢和上调Gclc、Gclm、Slc7a11、Slc3a2和Gpx4来抑制TCN，并通过构建的“蛋白质-通路-代谢物”网络分析揭示了铁死亡的特异性调控机制。机制上，他克莫司干预增加了细胞内Fe²⁺水平，通过下调Slc7a11和Slc3a2抑制了xCT系统活性，并降低了Gpx4水平，从而增加了铁死亡的易感性。来自 HK 的 Tamarixetin 和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷可以逆转这些影响，恢复 Slc7a11、Slc3a2 和 Gpx4 的表达水平，表现出与 Fer-1 相当的效果。

结论

代谢组学和蛋白质组学综合分析表明，HK通过抑制铁死亡来减轻TCN。这种保护作用是由其生物活性成分介导的，特别是槲皮素、柽柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷，它们通过上调Slc7a11/Slc3a2系统来增强GSH合成并抑制脂质过氧化。

01

研究背景及科学问题

他克莫司是一种具有强效免疫抑制作用的钙调磷酸酶抑制剂，已被广泛确立为肾移植受者一线治疗药物，用于减轻移植物排斥反应（Ong和Gaston，2021）。其长期肾毒性（TCN）是一个重要的临床挑战，即使他克莫司谷浓度维持在治疗范围内（5-8 ng/mL），仍有约20%的患者会出现TCN（Wojciechowski和Wiseman，2021；van Gelder等，2014；Kosoku等，2022）。TCN的早期表现通常包括肾功能受损和蛋白尿，这两者都被认为是导致慢性移植物功能障碍的主要因素（Bentata，2020）。临床证据表明，对血清和/或尿液样本中特定代谢组学和蛋白质组学特征进行定量分析，能够鉴别诊断肾功能损害，从而将这些分子特征确定为早期肾病检测的潜在生物标志物（Guo et al., 2019;Medyńska et al., 2024）。目前，TCN的治疗选择仍然有限，主要干预措施是降低剂量或停药。由此产生的临床困境凸显了开发安全有效的TCN治疗策略并保护患者长期健康的迫切性。

黄葵（Abelmoschus manihot(L.) Medic.）是锦葵科的一种植物，因其富含黄酮类化合物而具有药理学价值。其主要生物活性成分包括槲皮素、柽柳素、山奈酚及其衍生物（Wei et al., 2023）。在中国，黄秋葵在慢性肾脏病（CKD）的治疗中有着悠久的传统应用历史（Luan et al., 2020;Li et al., 2021b;Chen et al., 2025）。黄秋葵的乙醇提取物制成黄葵胶囊（HK），具有显著的肾脏保护作用（Zhang et al., 2014;Yan et al., 2025）。其治疗CKD的作用机制涉及多种途径，包括抗炎和抗氧化途径。己酮可可碱（HK）因其抗炎作用而闻名，其作用机制是通过阻断炎症通路和降低炎症标志物（Yan et al., 2025）。同时，HK还能通过增强抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD））的活性，并降低丙二醛（MDA）等毒性代谢物的水平来减轻氧化应激，从而减轻肾小管损伤（Li et al., 2021b）。此外，HK还能通过抑制免疫复合物的积累来重塑肾脏免疫微环境。这种重塑作用可以保护肾小球滤过屏障并减少尿蛋白漏（Wei et al., 2023）。临床上，HK单药治疗及其与标准肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂联合治疗均已证实对慢性肾脏病（CKD）具有良好的疗效。研究证实，这些治疗方法能有效维持肾功能的长期稳定，延缓终末期肾病的进展，且不良事件发生率始终较低（Zhang et al, 2014;Yan et al, 2025）。此外，HK还能有效改善肾移植后患者的蛋白尿并降低炎症因子水平（Yao et al, 2025;Xing et al., 2019;Wu et al., 2024）。尽管近年来HK的临床和基础研究不断增加，但其在TCN中的具体肾脏保护作用仍有待明确。此外，HK发挥抗TCN保护作用的完整分子机制和信号通路网络也尚未完全阐明。

代谢组学是一种通过分析小分子代谢物来表征病理状态的宝贵工具。它已被广泛用于阐明药物不良反应通路，并日益融入毒理学研究和安全性药理学评价中（Guo et al., 2022;Lim et al., 2023）。同样，蛋白质组学也已成为另一种强大的系统生物学工具，用于识别与毒性相关的蛋白质组学改变，同时阐明其潜在的机制网络（Deng et al., 2024;Fartade et al., 2025）。通过整合代谢组学和蛋白质组学数据，我们可以系统地分析细胞网络和疾病机制，从而显著增强我们对生物通路如何响应扰动的理解（Canzler et al., 2020;Dubin and Rhee, 2020;Hussain and Kingsley, 2025）。这种联合组学方法已在我们之前的研究中得到有效应用，用于阐明化疗引起的副作用的潜在机制并确定治疗策略（Li et al., 2021a;Yao et al., 2022）。

迄今为止，代谢组学已成为阐明HK对糖尿病肾病和顺铂诱导的肾损伤的肾脏保护机制的关键工具（Yan et al., 2025;Han et al., 2025;Liao et al., 2025）。代谢组学分析表明，HK可通过调节鞘脂和视黄醇代谢等代谢物来改善肾功能障碍。借助质谱成像分析进行化合物鉴定或16S rRNA测序，研究人员还鉴定了核心治疗靶点和药物活性成分。这些研究为HK治疗肾脏疾病的机制验证提供了宝贵的思路和整体框架。

在本研究中，我们建立了大鼠TCN模型，并采用肾脏代谢组学分析系统地定量分析了HK治疗后内源性代谢物的变化，从而阐明了与TCN病理生理相关的生化通路紊乱。同时，我们通过蛋白质组学分析鉴定了与TCN发病机制相关的潜在治疗靶点。随后，我们利用他克莫司诱导的肾损伤体外模型和分子对接技术验证了HK类黄酮与这些靶点的相互作用。综上所述，这一综合策略阐明了HK对TCN的保护机制，为其治疗潜力提供了新的分子层面的见解，并为未来HK介导的肾损伤代谢调控研究奠定了基础。

02

重要发现及亮点

3.1 . HK治疗显著缓解了大鼠的TCN症状并改善了肾功能。

与正常组（NOR组）相比，中毒组（MOD组）大鼠的体重增加显著降低（57.84 ± 16.27 g vs. 110.40 ± 3.71 g）（p< 0.001，图S1）。HK治疗逆转了这一趋势，其中HK-H组（2.8 g/kg/天）的恢复最为显著。同时，与正常组相比，中毒组的血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）和24小时尿蛋白（24-h UProt）水平显著升高（p< 0.001）。低剂量、中剂量和高剂量HK（HK-L、HK-M和HK-H）治疗均显著降低了这些指标，且呈明显的剂量依赖性。值得注意的是，HK-H组的血清肌酐、尿素氮、尿素氮和24小时尿蛋白水平显著低于正常组（图1A-D）。组织学分析（H&E染色和Masson染色）显示，MOD组肾小管管腔扩张、肾小球萎缩、炎性细胞浸润、大量蓝染胶原纤维以及明显的间质纤维增生，表明他克莫司诱导了明显的肾损伤。相比之下，所有HK治疗组的肾损伤均有不同程度的减轻，证实了HK对他克莫司肾病（TCN）的保护作用（图1E）。

图 1.HK可显著改善由他克莫司引起的慢性肾损伤导致的肾功能退化和肾组织病理损伤。

（AD）血清肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、血尿素氮（BUN）和24小时尿蛋白水平（n=8）。（E）苏木精-伊红（H&E）染色和Masson染色（×200）。（F）TUNEL染色（×40）。（GI）肾小球髓鞘形成蛋白-1（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）水平（n=8）。（JN）肾脏中转化生长因子-β1（TGF-β1）、I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和caspase-3的蛋白表达（n=3）。###与正常组（NOR ）相比，p < 0.001；* 与中度偏头痛组（MOD）相比，p< 0.05，** 与中度偏头痛组（MOD）相比，p< 0.01，***与中度偏头痛组（MOD）相比，p < 0.001。

3.2 . HK减轻了TCN大鼠肾组织细胞的凋亡，降低了肾损伤标志物水平和肾纤维化程度。

TUNEL染色结果显示，MOD组细胞凋亡显著增加，而HK-L、HK-M和HK-H治疗可显著降低细胞凋亡（图1F）。与此一致，HK给药后尿液中KIM-1、NGAL和8-OHdG的水平显著降低（图1G-I）（p< 0.01，p< 0.001）。高剂量HK使KIM-1从22.55 ± 3.2 pg/mL降至13.42 ± 2.10 pg/mL，NGAL从33.59 ± 1.09 ng/mL降至20.35 ± 1.41 ng/mL，8-OHdG从29.16 ± 2.25 ng/mL降至16.95 ± 2.31 ng/mL（p< 0.001）。 Western blotting进一步证实，与NOR组相比，他克莫司上调了MOD组中纤维化标志物（TGF-β1、胶原蛋白1和α-SMA）和凋亡标志物caspase-3的表达（p< 0.001）。HK治疗表现出这些蛋白的剂量依赖性降低，有效改善了肾纤维化（图1J-N）。

3.3 . HK改善了TCN大鼠的肾脏代谢紊乱

代谢组学数据的PCA分析表明，在正负离子模式下，质控样品均呈现紧密聚类，证实了分析流程的可靠性（图S2A-H）。PCA模型（图2A和2B）显示出清晰的组间分离，HK处理组的代谢谱向NOR组偏移。这一趋势表明，HK处理后他克莫司诱导的代谢功能障碍得到逆转。OPLS-DA进一步验证了这种分离，在NOR组和MOD组之间以及MOD组和HK-H组之间观察到了明显的聚类（图2C和2D）。代谢物鉴定后，分别从NOR组与MOD组以及MOD组与HK-H组的比较中鉴定出106种和125种差异代谢物（图2E）。随后的维恩图分析鉴定出80种在两组比较中均存在的差异代谢物（图2F）。表S1总结了NOR组、MOD组和HK-H组中80种差异代谢物的变化。对这些代谢物进行KEGG通路富集分析，结果显示33条通路显著富集。关键的显著富集通路（Impact > 0.1，p< 0.05）包括谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及精氨酸生物合成（图2H）。在这些通路中鉴定出9种关键差异代谢物：L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、焦谷氨酸、肌酸、谷胱甘肽和牛磺酸（图2I）。这些代谢物在NOR组、MOD组和HK-H组之间均表现出显著变化。同样，我们也分析了NOR组、MOD组和HK-L组或HK-M组之间的代谢谱变化。 OPLS模型清晰地展示了HK-L组（图S3A和B）和HK-M组（图S3C和D）与MOD组相比的代谢谱差异。差异代谢物筛选后，分别在HK-L组和HK-M组中鉴定出60种和62种差异代谢物（表S2和S3）。后续的KEGG通路富集分析表明，HK-L组和HK-M组中的差异表达代谢物显著富集于四个共同通路：谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及精氨酸生物合成（影响值>0.1，p<0.05，图S3B和D）。值得注意的是，这种富集模式与HK-H组的观察结果高度一致，表明HK治疗范围内代谢反应具有一致性。

图 2.非靶向肾脏代谢组学分析。

（A）正离子模式和（B）负离子模式下所有组的PCA二维得分图；（C，D）正负离子模式下两组之间的OPLS-DA二维得分图和置换检验结果；（E）两组之间上调和下调的代谢物；（F）差异代谢物的维恩图；（G）80个差异代谢物的热图；（H）差异代谢物通路图；（I）关键通路中9个差异代谢物的热图。

3.4 . HK对TCN大鼠肾脏缓解作用的蛋白质组学特征分析

质量控制分析证实了蛋白质组学数据的可靠性（图S4A-D）。在NOR组和MOD组之间共鉴定出364个差异表达蛋白（DEPs）（|log2 FC| > 1，p < 0.05），其中154个上调，210个下调（图3A）。同样，在MOD组和HK-H组之间鉴定出145个DEPs，其中64个上调，81个下调（图3B）。热图可视化了DEPs的表达模式，而维恩图则展示了两个比较中共有的112个蛋白（图3C和D）。基因本体（GO）富集分析揭示了各组之间不同的分子特征（图3E）。具体而言，DEPs主要参与细胞氨基酸分解代谢和谷胱甘肽代谢等生物学过程。这些分子功能包括抗氧化/氧化还原酶、谷氨酸-半胱氨酸连接酶和跨膜转运蛋白活性。细胞成分包括细胞外囊泡和线粒体基质。KEGG通路分析显示，差异表达蛋白富集于十条通路（p< 0.05），包括铁死亡、谷胱甘肽代谢以及蛋白质消化吸收（图3F，表S4）。随后，将这些通路中富集的24个蛋白组成一个关键蛋白簇，用于后续的整合分析。

图 3.MOD组的肾脏蛋白质组学特征与 NOR 组或 HK-H 组不同。

火山图：（A）NOR vs. MOD 和（B）MOD vs. HK-H；（C）差异蛋白的维恩图；（D）GO 功能分析结果；（E）差异蛋白的热图；（F）KEGG 通路的桑基图；（G）显著差异代谢物与蛋白相关性分析的热图；（H）蛋白-KEGG 通路-代谢物关联图，筛选出 7 条主要通路；（I）5 个关键蛋白和（J）3 个关键代谢物的表达水平变化；#p<0.001，###p<0.001 vs NOR 组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs MOD 组。

3.5 .综合代谢和原生质分析

相关性分析鉴定出7种关键差异代谢物，包括肌酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和牛磺酸，以及19种关键差异蛋白，包括Aadat、C1qb、Cndp1、Ddo、Folh1、Gclc、Gclm、Gpx1、Gpx4、Hnmt、Mep1a、Mme、Mrc2、Slc3a2、Slc6a19、Slc7a11、Tap1、Tubb6和Xpnpep2，这些蛋白与TCN的病理生理学相关（图3G，表1）。通路富集分析表明，多个关键过程存在显著失调，包括铁死亡、蛋白质消化吸收以及与谷胱甘肽、组氨酸和氨基酸相关的多种代谢通路。进一步构建的“蛋白质-通路-代谢物”网络分析表明，HK 通过增强谷胱甘肽合成来抑制铁死亡，从而减弱 TCN（图 3H-J）。

3.6 . HK抑制TCN中氧化应激诱导的铁死亡

与NOR组相比，MOD组的抗氧化标志物水平显著降低，包括GSH、SOD和CAT。相反，脂质过氧化产物MDA、铁死亡相关标志物Fe²⁺以及DHE荧光（ROS的指标）的水平显著升高（p< 0.001）。HK治疗呈剂量依赖性地减轻了这些改变，表现为GSH、SOD和CAT水平的恢复，以及MDA、Fe²⁺和DHE荧光水平的降低（图4A-F），其中HK-H组的效果最为显著。同时，Western blot分析显示，MOD组大鼠肾组织中关键铁死亡调节因子（Slc7a11、Gpx4、Slc3a2）的蛋白表达显著下调。 HK 治疗可剂量依赖性地逆转这种下调（p< 0.05，p< 0.01，p< 0.001），HK-H 组可显著地将 Slc7a11 和 Gpx4 的表达恢复到接近正常水平（p< 0.001）（图 4G-J）。

图 4.肾脏组织中铁死亡和谷胱甘肽代谢相关标志物。

（AE）SOD、MDA、Fe2+、CAT 和 GSH 水平（n=8）；（F）ROS 表达水平（×40）（n=3）；（G）谷胱甘肽代谢和铁死亡关键蛋白条带的蛋白质印迹结果；（HJ）Gpx4、Slc3a2 和 Slc7a11 的表达结果；###p<0.001 vs NOR 组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs MOD 组。

3.7 . HK类黄酮抑制他克莫司诱导的HK-2细胞损伤中氧化应激诱导的铁死亡

我们采用先前研究（ Zhang et al., 2025）中建立的方法鉴定了六种HK类黄酮，并据此进行了重新分析（图S5和S6，表S5）。它们对HK-2细胞活力的影响如图S7所示。他克莫司处理显著降低了HK-2细胞的活力，而六种黄酮类化合物中的任何一种都能减轻这种降低，其程度与阳性对照Fer-1相当（图5A，p< 0.001）。此外，他克莫司在HK-2细胞中诱导了显著的氧化应激反应，表现为MDA水平升高、GSH水平降低以及SOD和CAT活性降低（p< 0.001）。Fer-1的联合给药证实了铁死亡的参与，Fer-1能有效逆转这些生化改变。对HK类黄酮的比较评估发现，槲皮素、柽柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷是铁死亡最有效的抑制剂，因为它们显著地使所有四种氧化应激标志物的水平恢复正常。山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷和米奎利宁也能降低MDA水平并提高GSH水平，但它们对SOD和CAT活性的影响较小（图5B-E）。此外，Fer-1、槲皮素、柽柳素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷和山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷均能显著减弱他克莫司诱导的Fe²⁺积累（图5F）。透射电镜提供了铁死亡的超微结构证据，表明他克莫司导致严重的线粒体损伤，包括线粒体断裂、外膜破裂和嵴丢失。与Fer-1或黄酮类化合物联合治疗可显著改善这些形态学缺陷，其中槲皮素、柽柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷的保护作用最为显著（图5G）。

图 5.他克莫司诱导的 HK-2 损伤细胞中铁死亡相关标志物以及 HK 黄酮类化合物和 Fer-1 的发现。

(A) 细胞活力； (BF) SOD、MDA、CAT、GSH 和 Fe2+水平； (G)透射电子显微镜(×8000)； TAC，他克莫司；阙，槲皮素； Tam，柽柳西汀； Iso，异鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎宁。###与 NOR 组相比，p<0.001；与 MOD 组相比， *p<0.05，***p<0.001。

3.8分子对接分析和分子动力学模拟

六种HK类黄酮与Slc7a11（图6A）和Slc3a2（图6B）表现出很强的结合亲和力，结合能低于-7.0 kcal/mol。其中三种黄酮的亲和力最高：槲皮素与Slc7a11的结合能为-9.1 kcal/mol，与Slc3a2的结合能为-7.9 kcal/mol；柽柳素与Slc7a11的结合能为-9.2 kcal/mol，与Slc3a2的结合能为-7.9 kcal/mol；槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷与Slc7a11的结合能为-9.5 kcal/mol，与Slc3a2的结合能为-8.7 kcal/mol（表2）。分子动力学模拟（模拟时间超过100纳秒）表明，三种黄酮类化合物与Slc7a11（图6C）和Slc3a2（图6D）均能稳定结合，这体现在其较低的RMSD和RMSF值上。在这些黄酮类化合物中，槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷与这两种蛋白形成的复合物最为稳定。

图 6.分子对接模拟和分子动力学模拟。

槲皮素、柽柳黄素、异鼠李素、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸和米奎宁与(A) Slc7a11和(B) Slc3a2结合； (C) Slc7a11 和 (D) Slc3a2 的 RMSD 图表。 TAC，他克莫司；阙，槲皮素； Tam，柽柳西汀； Iso，异鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎宁。

表2.化合物-蛋白质复合物的结合亲和力

3.9 . HK通过xCT/GPX-4信号通路抑制铁死亡

在HK-2细胞中，他克莫司暴露显著抑制了Gpx4、Slc7a11和Slc3a2的表达水平（p< 0.001）。槲皮素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷、柽柳素和山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷均能有效逆转这种抑制作用（图7A-D）。这些结果证实，HK及其活性成分在体内外均能通过xCT/Gpx4信号通路拮抗他克莫司诱导的铁死亡。

图7.类黄酮影响HK-2 细胞中 Slc7a11、Gpx4 和 Slc3a2 的蛋白表达水平。(A) 蛋白质条带； (B)Slc7a11； (C)GPX4； (D)Slc3a2。 TAC，他克莫司；阙，槲皮素； Tam，柽柳西汀； Iso，异鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎宁。###与 NOR 组相比，p<0.001；与 MOD 组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001。

【Citation】Pang T, Tang T, Wang Y, Li J, Yang L, He Y, Yang H, Han J, Tao X, Chen W, Zhang F. Integrated metabolomics and proteomics analysis elucidated the therapeutic effect of Huangkuui Capsule on tacrolimus-induced chronic nephrotoxicity in rats.Journal of Ethnopharmacology.2026.1.13.