V1超柱中持续活动的动态分组

Dynamic grouping of ongoing activity in V1 hypercolumns

V1超柱中持续活动的动态分组

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1053811925001594

摘要
神经元的自发活动为理解大脑提供了丰富信息。单个神经元的活动与其局部网络密切相关。为了理解这种关系，我们利用双光子钙成像技术研究了猕猴V1和V2区数千个神经元的自发活动。在V1中，持续活动主要由全局波动主导，其中大多数神经元的活动彼此相关。神经元的活动还依赖于它们在局部功能结构（包括眼优势图、朝向图和颜色图）中的相对位置。具有相似偏好特性的神经元会动态地聚集成共激活的神经元集群，并呈现出与局部功能图相似的空间模式。不同的集群具有不同的强度和频率。这一现象在我们所检测的所有V1超柱尺度区域中均一致存在。在V2中，不同成像位点具有不同的朝向和颜色特征；然而，在所采样的区域内，自发活动同样与底层的功能结构相关。这些结果表明，功能结构在影响神经元自发活动中起着关键作用。

关键词：猕猴 V1、V2；自发活动；神经元集群；功能图；双光子钙成像；功能连接

1. 引言

当我们观察单个神经元时，其自发活动看起来是随机的。然而，当同时观察更多神经元时，我们发现神经元的自发活动常常彼此相关，尤其是空间上邻近的神经元（Leopold 等，2003；Smith 和 Kohn，2008；Smith 和 Sommer，2013）。这种相关性的强度随神经元的选择性特征及其位置而变化（Maier 等，2010；Okun 等，2015）。这种变化可能源于皮层内在的功能网络，例如朝向图（Arieli 等，1995，1996；Tsodyks 等，1999；Singh 等，2008；Cai 等，2023）。然而，目前仍缺乏此类依赖关系的直接证据。

在非人灵长类动物中，其感觉皮层存在多种功能结构。例如，在V1区存在朝向图、颜色图和眼优势图。在Hubel和Wiesel提出的超柱模型中，一个面积约为1 mm²的皮层柱状区域包含了上述所有特征的完整周期（Hubel 和 Wiesel，1974）。这些嵌套的网络如何影响神经元的自发活动？单个神经元的活动是否由其在这些功能图中的空间位置所决定？这些问题的答案目前尚不清楚。

双光子钙成像技术能够在约1 mm²大小的皮层区域内同时记录数百至数千个神经元的活动。该技术已被用于研究不同动物模型中的自发活动，例如小鼠（Goltstein 等，2015；Mizuno 等，2018）、大鼠（Ch’ng 和 Reid，2010）、猫（Ch’ng 和 Reid，2010）以及雪貂（Smith 等，2018）。据我们所知，目前尚无关于非人灵长类动物自发活动的双光子研究报道。此前，我们曾利用双光子钙成像技术研究了神经元的视觉反应特性（Tang 等，2020）。在此，我们使用相同的技术考察了自发活动。我们根据神经元在其局部功能图中的空间位置及其对视觉特征的选择性，对其自发活动进行了表征。作为脑科学研究的经典模型，猕猴的自发活动已在微观尺度（电生理）和宏观尺度（fMRI）上被广泛研究。双光子成像具有独特的分辨率与观测尺度，能够连接并整合这两类研究结果。

1. 结果

我们在3只猕猴的V1和V2多个位点注射了AAV病毒以表达GCaMP6s蛋白，并植入了直径为13 mm的慢性光学窗口（图1A和B）。在随后的麻醉实验中，我们使用16倍物镜采集钙信号，成像视野大小为0.83 × 0.83 mm，帧率为1.3 Hz，成像深度为180–270 μm。每次实验均首先进行自发活动成像，通常持续70分钟（约5000帧），期间动物双眼闭合。之后，对同一群神经元采集其视觉反应数据。视觉刺激为不同颜色和朝向的漂移光栅，以单眼或双眼方式呈现，每种刺激持续2秒。每个成像位点可识别出约400–600个细胞（平均569个）（例如，图1C）。神经元荧光活动的时间序列经过滤波（高通截止频率0.005 Hz）、转换为dF/F，并进行z-score标准化。以下所有结果均基于这些 n × m（细胞数 × 帧数）矩阵（例如，图1F）。

在另一组独立实验中，我们还对这些光学窗口进行了内源信号光学成像，并获得了基本的功能图谱，用于与双光子成像所获得的功能图谱进行比较（图S1）。

2.1 自发活动的基本特征
在单个神经元中，自发钙信号表现为看似随机的波动（图1D），其幅度小于视觉驱动反应的幅度（图1E）。在群体水平上，神经元表现出爆发式的共激活现象（图1F）。这些爆发通常涉及不同的神经元参与者，且某些自发活动帧的空间模式与刺激诱发的模式相似（即功能图谱，图1I&J）。这表明自发形成的神经元集群并非随机产生，而是由某种内部机制所组织，该机制所产生的模式类似于外部刺激的作用效果。作为对照，若对每个神经元的自发活动进行相位重排（phase-shuffled），整体模式则完全不同（图1H），且无法观察到此类空间模式（例如图1K）。

在单神经元层面，其自发激活率相近，范围约为0.01~0.05 Hz（图1L&M）。其平均波动幅度约为视觉刺激下波动幅度的67%（图1N&O）。在群体层面，自发集群以平均0.15 Hz的频率动态形成，每个集群持续约3秒（图S2C）。无论是集群事件还是单细胞事件，其“爆发性”（burstiness）均低于随机分布，表明自发事件在时间上分布更为均匀（图S2 E&I）。集群规模（共激活神经元数量）与出现频率（该规模集群被观测到的频率）呈负相关（图S2C）。

2.2 群体活动中朝向模式
主成分分析（PCA）是一种有用的数据驱动分析工具，常用于fMRI数据分析（Carbonell 等，2011）。针对高维的自发活动数据，我们使用PCA降低其维度。如图2A所示，PCA沿细胞轴（cell axis）进行了降维。降维后，前10个主成分（PCs）平均解释了总方差的39.4 ± 5.6%（来自全部8个V1位点的平均值，图2C），表明该方法有效。图2B展示了某一示例位点的PC空间及自发活动数据，该数据包含约70分钟内采集的5352帧，每一点代表一帧。数据点主要聚集为一个云团，未形成明显分离的簇，表明在成像期间不存在多个主导性的离散状态。

在沿细胞轴降维后，每个主成分可被视为一个“假设神经元”，其活动是原始神经元活动的加权和。因此，每个PC可被可视化为一帧权重图（例如图2D）。PC1表现为一种全局模式，其中所有神经元均具有较高权重。事实上，其时间进程几乎与所有神经元z-score标准化活动之和完全一致（图S3B）。它解释了数据中26.4 ± 4.5%的方差，表明整个成像区域内神经元的共激活是自发活动中最主导的成分。其余PCs解释的总方差小得多，但各自具有空间模式：其中一些与该区域的朝向图相似（图2E&F），另一些则与眼优势图或颜色图相关性更高（图2E）。这些相关性显著高于相位重排后的对照数据（图2G）。

作为对照，我们对每个神经元的自发活动进行了相位重排（与图1H相同），并对重排后的数据执行相同的PCA。结果表明，所得主成分解释总方差的能力极低（前10个PC仅解释3.2 ± 0.5%的方差，图S4B），且可视化后的PC既无系统性空间模式，也与功能图谱无显著相关性（图S4 C&D）。这进一步支持我们观察到的自发活动模式本质上是非随机的。

由于PC轴中包含了朝向信息（图2E&F），我们可通过将朝向反应数据投射到该PC空间来验证这一点。我们将神经元对光栅刺激（新数据）的反应投射到由自发活动分析得到的PC空间（旧空间）中。如图3B所示，8种不同朝向的光栅刺激（以不同颜色表示）所对应的帧在PC空间中聚集成8个分支，相邻分支对应相邻朝向。这证明该空间确实按照朝向信息进行了组织。

有了刺激帧在PC空间中的坐标后，我们进一步检验自发活动帧是否可被分类为不同的朝向类别。我们使用朝向刺激帧的PC坐标训练了一个SVM分类器（图3B），仅使用前10个PC轴的坐标，在9类分类任务（8个朝向 + 1个空白）中达到了85.8%的正确率（5折交叉验证）。随后，我们将该分类器应用于自发活动帧。结果显示，23.2%的自发帧被分类为朝向帧，其余76.8%被归类为空白（图3C）。与刺激帧在PC空间中呈现的分离分支（图3B）相比，自发帧的分布更为连续（图3C），表明自发活动中朝向表征更加均匀。在SVM分类中贡献最大的是PC2、PC3和PC4，因此用于可视化PCA结果（图3A–C）。

最后，每一朝向类别下平均的自发活动帧与相应刺激条件下的平均帧高度相似（图3D&E），其相关系数显著高于使用人工合成刺激数据获得的对照值（图S5）。相关系数约为0.7，进一步证实了这些神经元中存在朝向特异性的共激活现象。尽管PC1代表全局活动，并不贡献于特定朝向模式，但PC1权重较高的帧更有可能被分类为朝向模式（图S3 D&E）。

2.3. 自发活动中眼优势与颜色模式
在每次实验中，我们还记录了神经元对单眼黑白光栅以及双眼彩色光栅刺激的反应。我们采用与前述相同的方法，将这些由刺激驱动的数据（帧）投影到利用自发活动数据所获得的旧主成分（PC）空间中（即与图2B相同）。图3G显示，在左眼刺激（红色）和右眼刺激（蓝色）期间采集的帧在PC空间中被清晰地分开。随后，使用这些帧坐标训练的支持向量机（SVM）分类器将6.8%的自发活动帧识别为单眼激活帧（图3H）。这一结果也通过自发活动帧的平均模式与左眼或右眼功能图之间的相似性得到了验证（图3I和J）。

我们还考察了颜色反应模式是否存在于自发活动中。采用相同方法，我们发现部分自发帧也可被归类为与彩色光栅刺激所获得的帧相似（图S6C）。然而，平均后的彩色自发活动模式与彩色功能图之间的相似性较弱（图S6D和E），其相关系数范围为0.15至0.59（总体Pearson相关系数 r = 0.41 ± 0.11）。我们由此得出结论：尽管颜色选择性神经元的共激活确实存在于自发活动中，但其稳健性不如朝向和眼优势相关的模式。这与我们之前利用内源性光学成像所得出的结果一致（Cai et al., 2023）。

到目前为止，自发活动模式仅以神经元形式呈现（图3D和I，图S6D）。我们还以帧的形式考察了相应的自发活动模式（图S7），即对被分类出的帧的原始dF/F信号进行平均。尽管相关得分较低，但相应自发模式与功能图之间的整体相似性仍然明显（图S7）。

在8个V1成像位点中，我们都观察到了清晰的朝向和眼优势模式存在于自发活动中。这些模式与对应功能图的平均相关系数达到0.8，不同成像位点间的变异很小（图3K）。作为对比，颜色模式的相关系数仅为0.41。这些模式的出现频率在不同实验之间有所差异（图3L），这可能源于各次实验中动物麻醉状态的不同。一次实验中朝向和眼优势模式的出现频率通常呈正相关（图3L），这也支持上述假设。总之，这些观察结果表明，具有共同偏好（如朝向、眼优势）的神经元不仅在视觉刺激期间协同激活，在持续的自发活动中也是如此。

2.4. 具有相似调谐特性的神经元之间的相关活动
迄今为止，我们在神经元维度上进行了主成分分析（PCA）降维。同样地，我们也对帧维度进行了PCA，以考察神经元是否能基于这种数据驱动方法聚类。如图4A所示，每个PC轴代表一个帧，而帧空间中的每个数据点代表一个神经元。该帧空间的维度更高，因为前20个主成分仅解释了25.3 ± 3.5%的方差（图4B）。然而，我们观察到不同朝向偏好神经元在此PC空间中存在分离（图4C），左眼偏好与右眼偏好神经元之间也存在分离（图4D）。这表明具有相同调谐偏好的神经元表现出相似的自发激活模式，且这些调谐特征（眼优势、朝向）是影响神经元自发活动的主要因素之一（体现在前几个主成分中）。

我们计算了偏好0°和90°神经元的平均向量，以及偏好45°和135°神经元的平均向量（图4C中的箭头）。对这些向量的可视化显示出朝向模式（图S8A和B）。这两个向量在高维PC空间中彼此正交（图S8D）。此外，这两个向量也都与眼优势神经元的向量（图4D中的箭头，另见图S8D）正交。这些观察结果表明，这些因素对神经元自发活动的影响是相互正交的，不同的功能网络具有独立的活动，彼此互不干扰。

这些结果也可以直接通过对神经元自发活动进行两两相关性计算得到。尽管大多数神经元呈正相关（由于全局信号），但相关程度存在差异。图4E显示，当神经元间距增大时，相关性下降；最高相关性出现在间距较短（约200 μm）的神经元对中（图4E）。该数值与V1神经元基底树突扩展的平均尺度以及V1神经元轴突终末斑块的大小相当（Lund et al., 1993；Lund and Wu, 1997）。图4F显示，具有相似朝向偏好的神经元之间相关性更强。图4G显示，具有相似眼偏好的神经元之间相关性也更强；而眼偏好较弱（双眼神经元）或眼偏好不同的神经元对则相关性较弱。

2.5. V2中的自发活动
我们还在V2区成像了3个位点。这3个位点位于V2条纹（stripes）的不同位置，其具体位置由内源信号光学成像获得的功能图所标示（图S1）。与V1神经元不同，V2神经元大多为双眼性，且无眼优势或眼偏好较弱。此外，不同的条纹在朝向选择性和颜色选择性方面表现出显著差异。

我们对V2数据进行了与前述相同的分析。图5A展示了一个位于厚/浅条纹（thick/pale stripe）位点的数据。该位点具有较强的朝向选择性，但颜色选择性较弱。相应地，其自发活动中提取出的朝向模式很强（图5E），而颜色模式则很弱（未显示）。图5F展示了另一个位于细条纹（thin stripe）的V2位点的数据。该位点的自发活动表现出强烈的颜色模式（图5J），其相关系数（约0.5）高于在V1中观察到的所有值（图5K）。

因此，与V1类似，V2中的自发活动也呈现出与底层功能结构相关的模式。然而，这两个区域之间也存在差异。例如，V2的颜色相关自发模式比V1更强。此外，由于成像区域较小，而V2的功能结构尺度较大，所成像的3个V2区域表现出非常不同的特征。相比之下，在V1中，8个成像区域具有相似的特性，表明这些成像区域的尺度接近V1的功能单元——超柱（hypercolumn）。

我们分析了麻醉猕猴V1和V2区群体神经元的自发活动。我们发现，神经元动态地形成了不同的活跃集群（active ensembles）。这些集群与已知的功能结构高度相似，包括不同的朝向偏好模式、眼优势模式和颜色模式。因此，具有共同选择性的神经元倾向于表现出更强的相关活动。在V1中，朝向和眼优势对神经元自发活动均有显著影响，而颜色的影响较弱。在V2中，根据具体记录位点的不同，朝向和颜色可能对神经元自发活动产生强或弱的影响。这些结果为“自发活动依赖于底层功能结构”这一假说提供了直接证据。不同的功能结构对自发活动的贡献程度不同。此外，这些神经元层面的证据支持了先前通过电压敏感染料成像（Omer et al., 2019）和血流动力学成像（Cai et al., 2023）获得的结果，并证实了他们所观察到的介观尺度功能连接具有神经起源。

3.1. 模式化自发活动的偏好性水平连接模型

这些类似功能结构的激活模式在很大程度上可由非均匀的水平连接（horizontal connections）来解释。以往研究表明，在具有相似调谐特性的神经元之间存在偏好性的水平连接，包括朝向偏好（Gilbert and Wiesel, 1989；Kisvarday et al., 1997）、眼优势（Malach et al., 1993；Yoshioka et al., 1996）以及颜色偏好（Livingstone and Hubel, 1984；Yoshioka et al., 1996；Yabuta and Callaway, 1998）。这些领域特异性（domain-specific）的连接与大量领域非特异性（domain-non-specific）的连接共存，后者连接的是距离较近的神经元，其范围大致相当于神经突起（neurites）形态扩展的尺度（约200 μm；Lund et al., 1993；Lund and Wu, 1997；Malach et al., 1993；Yoshioka et al., 1996）。我们在短距离内观察到的强两两相关性（图4E）正与此类短程的领域非特异性连接一致。这些水平连接构成了相关性持续活动的形态学基础。

如图6中的概念模型所示，V1中的自发活动既受到外部输入（例如来自外膝体LGN和V2的输入）的影响，也受到区内连接（基于当前已有知识绘制）的调控。领域非特异性连接（图6C中的灰色连线）是我们在实验中观察到的全局活动（图2中的PC1）的形态学基础；而不同类型功能域之间的领域特异性连接（图6C中的蓝色和红色连线）则是多种自发活动模式（例如图2中的PC2）的基础。单个V1神经元通常位于多种类型网络（如眼优势、朝向、颜色）的交汇处，当它从上游区域和水平连接接收到足够输入时就会发放。其激活也会通过这些非均匀的连接对其周围神经元产生非均匀的影响。正如我们所展示的那样（图S3D），这两种类型的连接通常是共同激活的，因为PC1和PC2的强度呈正相关。已有研究表明，相比于围绕单一背景状态的自发波动，这种多状态的自发活动通常是缓慢且低维的（Goldberg et al., 2004），这与我们的观察结果一致。

除了水平连接之外，LGN中的自发活动也会影响V1的活动，同时来自高级皮层的自上而下反馈（图6）亦有贡献。然而，阻断视网膜或LGN输入并不会消除这些模式化的自发活动（Chiu and Weliky, 2001；Smith et al., 2018）。此外，来自高级皮层的反馈通常是特征非特异性的（Stettler et al., 2002）。因此，尽管这两个因素可能对全局成分有所贡献，但对于模式化的自发活动而言并非必需。水平连接在这些自发活动模式中起主导作用。

3.2. 自发模式具有普遍性

双光子钙成像已被广泛用于研究多种物种中的自发活动。例如，在小鼠（Goltstein et al., 2015；Mizuno et al., 2018）和大鼠（Ch’ng et al., 2010）中，已有研究表明，具有共同感觉信息偏好的神经元倾向于同步活动。具有共同偏好的神经元之间也存在更强的相互连接（Ko et al., 2011），这些连接在睁眼后以刺激依赖的方式形成（Ko et al., 2013）。这些内部生成的模式通常与刺激诱发的模式具有相似的结构（Mohajerani et al., 2013；Luczak et al., 2015）。在清醒小鼠中，感觉皮层的自发模式还能编码动物的自发行为，例如面部运动（Stringer et al., 2019）。在雪貂（Smith et al., 2018；Mulholland et al., 2021）和猫（Ch’ng et al., 2010）中，也观察到了自发的朝向图。在本研究中，我们除了观察到朝向图外，还发现了自发的眼优势图和颜色图。因此，这似乎是一种跨物种的普遍特征。

自发活动与功能结构之间的相关性也在其他感觉皮层中被观察到。例如，多电极记录在大鼠听觉皮层中提供了此类证据（See et al., 2018）；猕猴STP区的皮层脑电图（ECoG）记录揭示了自发活动中存在音调拓扑组织（tonotopic organization）（Fukushima et al., 2012）；体感和运动皮层的内源信号光学成像也揭示了功能连接（Card et al., 2022）。在更高级的脑区，例如前额叶皮层（PFC），自发活动也揭示出不同的亚区域（Kiani et al., 2015）。因此，自发活动对功能结构的依赖已在不同脑区、不同物种中被反复观察到。鉴于这两者高度相关，我们提出：自发活动中未知的模式可作为发现新功能结构的指标。这对研究高级脑区具有重要的方法学意义——因为这些区域通常过于复杂，难以通过传统刺激或任务进行有效研究。

3.3. 方法学比较

本研究结果支持我们先前通过内源信号光学成像（ISOI）获得的发现（Cai et al., 2023）。两项研究采用了相似的实验流程，均在V1中发现了三种类型的自发模式：其中朝向和眼优势模式较强，而颜色模式较弱。在两项研究中，自发事件的持续时间相近（内源信号：约4秒；钙信号：图S2D中为3秒），时间频率也相似（内源信号：0.02–0.03 Hz；钙信号：图1L&M中<0.1 Hz）。因此，本研究结果支持血流动力学信号所观测到的功能连接（FC）具有神经起源，并证实此类信号在研究介观尺度功能连接中的有效性（Vasireddi et al., 2016；Card et al., 2022；Cai et al., 2023）。

功能性磁共振成像（fMRI）揭示了大脑中大尺度、长距离的功能连接（Fox and Raichle, 2007）。然而受限于空间分辨率，fMRI无法检测亚毫米级的功能连接，例如V1内不同朝向模块之间的连接。电压敏感染料成像（VSD）、内源信号光学成像（ISOI）和广域荧光成像等光学方法在揭示介观尺度功能连接方面非常有用，但无法与单神经元活动直接关联。双光子成像则兼具良好的空间与时间分辨率，是研究精细尺度功能连接的重要工具。我们的结果不仅展示了介观尺度的功能连接，还揭示了一个全局信号（PC1），视野内所有神经元均对其有所贡献。该全局信号具有缓慢的时间频率（<0.1 Hz，见图1L&M），可能对应于fMRI中观察到的超慢活动（infra-slow activity）（Fox and Raichle, 2007）或广域钙成像中的类似信号（Mitra et al., 2018），从而为静息态BOLD信号提供了细胞层面的支持。

3.4. 本研究的局限性

本研究在麻醉动物中进行。尽管已有研究表明，麻醉与清醒状态下存在相似的功能连接模式（Vincent et al., 2007），但一些研究也指出，在麻醉动物中，自发模式更强（Omer et al., 2019）。此外，所使用的麻醉药物类型也可能影响观测到的功能连接强度（Muta et al., 2023）。近期在清醒动物中进行的大规模记录揭示了更复杂（更高维）的自发活动，其中部分可能与动物行为相关（参见Avitan and Stringer, 2022综述）。这些行为或认知因素更具变异性，为自发信号增添了额外的复杂性。相比之下，麻醉动物的自发信号更简单、更易于分析，可为后续研究提供基线参考。

从信号角度看，我们所分析的钙信号较慢，且包含阈下神经元活动，与动作电位（spike）信号有所不同。最后，本研究采用的主成分分析（PCA）旨在检测神经元群体中的共性活动，因此未考察单个神经元的特性。

1. 材料与方法

4.1. 动物本研究
对三只成年猕猴（两只恒河猴 Macaca mulatta，一只食蟹猴 Macaca fascicularis，分别来自北京协尔鑫生物资源研究所和湖北拓普基因生物科技有限公司）进行了成像。所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经北京师范大学实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准（批准号：IACUC(BNU)-NKCNL2016–06）。

4.2. 手术流程

动物首先用氯胺酮（ketamine，10 mg/kg）或Zoletil 50（替来他明盐酸盐和唑拉西泮盐酸盐，4 mg/kg）进行镇静。随后将其固定于立体定位仪上，并通过异氟烷（isoflurane，1.5–2.5%）进行人工通气麻醉。在枕叶区域实施直径22–24 mm的圆形颅骨开窗术（craniotomy）及硬脑膜切开术（durotomy），以暴露V1和V2的部分皮层。开窗中心位于中线外侧18 mm、后颅骨嵴前14 mm处（图1A）。

在每只动物中，我们将AAV9.Syn.GCaMP6S.WPRE.SV40病毒（Addgene ，滴度 ≥ 1 × 10¹³ vg/mL）注射至10–15个皮层位点（每个位点520 nL），注射深度为600–800 μm。随后，用人工硬脑膜覆盖暴露的皮层，将原硬脑膜复位并用医用胶水粘附于人工硬脑膜之上。原颅骨片被放回原位，并用钛网和骨螺钉固定。头皮缝合。病毒表达至少8周后，进行第二次手术：重新打开原有颅窗，进行第二轮病毒注射，随后植入一个光学钛合金成像腔（内径/外径：13/15 mm）。

4.3. 双光子钙成像

动物术后恢复后，每隔7–10天进行一次双光子钙成像。动物准备流程与手术时基本相同，但头部需倾斜约45°，以对齐固定的垂直成像光轴。

麻醉方式由异氟烷切换为静脉输注丙泊酚（propofol，诱导剂量2 mg/kg，维持剂量2 mg/kg/hr）与舒芬太尼（sufentanil，诱导剂量0.15 μg/kg，维持剂量0.15 μg/kg/hr）的混合液。为防止眼球运动，使用维库溴铵（vecuronium bromide，诱导剂量0.25 mg/kg，维持剂量0.05–0.06 mg/kg/hr）进行肌肉松弛。通过持续监测心电图、呼气末二氧化碳、血氧饱和度和体温评估麻醉深度。为确保麻醉状态稳定，成像通常在切换麻醉方式一小时后才开始。

每次成像实验中，自发活动记录始终在视觉刺激实验之前进行。此时猴子双眼闭合并额外覆盖眼罩。激光激发波长设为980 nm（Chameleon Ultra II 激光源，Coherent公司）。使用16×物镜（数值孔径0.8，Nikon），以1.3 Hz帧率连续采集515 × 512像素的图像，覆盖830 × 830 μm的皮层表面（Bruker Ultima IV Extended Reach 系统，Bruker Nano公司）。成像平面位于皮层下180–270 μm深度。自发成像时段通常持续1–2.5小时，期间尽量保持环境黑暗、安静以减少干扰。

自发成像结束后，打开猴子双眼，使用托吡卡胺（tropicamide）散瞳，并佩戴合适曲率的隐形眼镜，使其聚焦于57 cm远处的刺激屏幕。屏幕上投射光学圆盘以粗略估计中央凹位置。视觉刺激实验中的图像采集方式与自发实验相同。每个视觉刺激呈现1.5秒，间隔0.5秒（即刺激间间隔ISI = 0.5 s），且每次刺激起始时间与图像帧扫描起始同步。

在成像过程中，观察到皮层在视野内存在缓慢漂移。在6–8小时的实验过程中，X-Y平面漂移通常小于100 μm，Z轴方向漂移小于80 μm。我们频繁检查细胞形态特征，并相应调整焦平面位置。X-Y平面的漂移在离线数据分析阶段进一步校正。

4.4. 视觉刺激

视觉刺激由ViSaGe系统（Cambridge Research Systems Ltd.）生成，并呈现在距眼睛57 cm的21英寸LCD显示器（Dell E1913Sf）上。刺激屏幕经过伽马校正，刷新率为60 Hz。通过一对9°棱镜使左、右眼视野在屏幕上分离，避免重叠；并在两眼之间放置黑色隔板，防止交叉刺激。黑白光栅刺激中，白色条纹的亮度为100 cd/m²。每次运行中，刺激按随机顺序呈现。

4.5. 用于感受野（RF）定位的刺激

使用直径2.5°的圆形光栅斑块，在5 × 5网格位置上呈现。每个光栅为矩形波形（占空比0.2；空间频率1.5 c/deg；时间频率8 c/sec），并沿4个不同漂移方向（45°、135°、225°、315°）呈现。每种刺激重复3次（总计5 × 5 × 4 × 3 = 300次试验）。感受野位置在线分析后用于后续刺激定位。左右眼分别进行映射，所记录神经元群体的感受野偏心度为3–5°。

4.6. 用于估计神经元眼优势的刺激

使用7° × 7°的光栅斑块，分别单眼呈现给左眼或右眼。左右眼各自映射出的感受野中心位置被用作该方形光栅斑块的中心位置。光栅为矩形波（占空比0.2；空间频率1.5 c/deg；时间频率8 c/sec）。刺激采用区组设计（block design），每个区组包含9种条件：4个朝向（0°、45°、9 °、135°）、两个眼位（左/右眼）以及一个空白对照条件。光栅沿垂直于条纹的方向随机漂移。通常呈现20–30个区组。

4.7. 用于估计神经元朝向偏好的刺激

与眼优势刺激类似，也使用光栅斑块进行朝向测试，不同之处在于左右眼刺激同时通过全屏光栅呈现。每个区组包含17种条件：8个朝向（以22.5°为步长），每个朝向沿两个相反方向漂移，另加一个空白对照条件。

4.8. 用于估计神经元颜色偏好的刺激
颜色刺激为全屏正弦波光栅（空间频率 SF = 0.15 c/度，时间频率 TF = 1 c/s）。每个区组包含29种条件：1个空白对照条件，以及7种不同颜色的光栅，每种颜色分别在4个朝向（0°、45°、90°、135°）上呈现，并沿垂直于光栅条纹的两个方向中随机选择一个方向进行漂移。

这7种颜色分别为：红色（255,0,0）、黄色（255,255,0）、绿色（0,255,0）、青色（0,255,255）、蓝色（0,0,255）、紫色（255,0,255）和白色（255,255,255）。
白色光栅的平均亮度为50 cd/m²，蓝色光栅为7 cd/m²，其余所有彩色光栅的平均亮度均为20 cd/m²。

1. 数据分析

5.1. 细胞识别

我们首先使用CalmAn工具箱 v1.9.15（Giovannucci 等，2019）和Python v3.10.8进行运动校正和细胞识别，并获得各个神经元的荧光强度时间序列。

5.2. 预处理

每个时间序列首先使用Butterworth滤波器（5阶，0.005 Hz高通）进行滤波，以去除缓慢漂移的背景信号和呼吸噪声。随后，计算荧光变化量 dF/F = (F - F0) / F0，其中 F0 为当前运行中最低10% F值的平均值。

在进行主成分分析（PCA）之前，我们对dF/F序列进行了Z分数标准化，公式为 Z = (dff - dff̄) / σdff，其中 dff 是当前帧的dF/F值，dff̄ 是该序列的平均dF/F值，σdff 是该序列dF/F的标准差。

5.3. 视觉特征偏好

神经元的眼优势通过Cohen’s D指数评估：D = t / √N，其中 t 为对4个左眼刺激和4个右眼刺激响应的t检验值，N 为样本数。

神经元对16种朝向光栅的反应通过改进的von Mises函数拟合（Mardia, 1972）：y = a₀ + b₁e^c¹ × cos(θ - θ_best) + b₂e^c¹ × cos(θ - θ_best - π)。若神经元的R² > 0.7，则认为其具有朝向选择性，并从该拟合函数中提取其最优朝向。

神经元的颜色选择性通过比较其对每种彩色光栅与黑白光栅的响应（t检验）来评估。若t值大于0且p < 0.05，则认为该神经元对该颜色具有选择性。因此，一个神经元可能对多种颜色均有偏好。

5.4. 功能图谱

我们为每个成像位点分别获得了眼优势、朝向和颜色的功能图谱。每种功能图谱均包含两种类型：单条件图谱和差异图谱。以眼优势图谱为例，存在两个单条件图谱：左眼条件图谱和右眼条件图谱，两者均通过对每个细胞的Z分数取平均得到。差异图谱则是一个基于左右眼Z分数计算的Cohen D图谱。对于神经元的功能图谱，每个神经元被简化为其原始位置处的一个小圆盘，并赋予上述计算所得的数值。

5.5. 随机打乱的数据
我们使用相位随机化（phase-shuffled）的自发活动数据作为对照：首先对每个神经元的Z分数时间序列进行傅里叶变换，然后将频谱的相位随机打乱。随后，将这些经过相位打乱的频域数据逆变换回时域。这样生成的打乱后时间序列保留了与原始序列相同的功率谱。

5.6. 主成分分析（PCA）
主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）是一种有用的数据驱动分析工具，常用于fMRI研究（Carbonell et al., 2011）。对于自发活动数据，我们采用两种方式分别进行降维。第一种如图2A所示，对Y轴方向（神经元维度）进行降维；第二种如图4A所示，对X轴方向（帧维度）进行降维。

5.7. 基于PCA结果的SVM分类
为了检验自发活动帧与刺激诱发帧之间的相似性，我们结合了PCA与支持向量机（SVM）分类方法。首先，我们在自发活动数据上进行PCA，以降低神经元维度。然后，将刺激条件下获得的帧投影到该PCA空间中。我们使用前10个主成分维度中的坐标训练一个SVM分类器（scikit-learn工具箱，v1.3.0）。最后，利用该训练好的SVM分类器对自发活动帧进行分类。

5.8. 自发活动图谱
基于上述流程，我们获得了与刺激诱发帧相似的自发活动帧。连续的一段被分类出的帧被视为一个“事件”（event）。自发活动图谱可按照与刺激图谱相同的方式进行计算。

5.9. 爆发性指数（Burstiness Index）
参照Wagenaar等人（2005）所描述的方法，我们通过将整个成像序列划分为160个时间窗口，来刻画群体和单细胞活动的爆发性（burstiness）。具体而言，我们计算了在活动最强的前15%时间窗口（本例中为24个窗口）中发生的总事件所占的比例。爆发性指数（BI）定义为：

其中表示在这些前15%高活动窗口中发生的事件占总事件的比例。在均匀分布的假设下，BI趋近于零；而BI值越高，则表明自发活动在时间上具有更强的爆发性。