AbMole | 揭示SIRT6-H3K9la-MGMT轴：提升TMZ敏感性关键通路

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）作为最具侵袭性和致命性的原发性脑肿瘤，其临床管理长期面临严峻挑战。尽管烷化剂替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）因其良好的血脑屏障穿透能力而被确立为一线干预化合物，但超过半数的患者最终会表现出先天或获得性耐药，这直接导致了高达90%以上的复发率，构成了GBM临床预后改善的主要瓶颈。TMZ的细胞毒性作用主要通过将甲基基团转移到DNA鸟嘌呤的O6位点，形成O6-甲基鸟嘌呤（O6-MeG）加合物，进而引发DNA损伤和细胞死亡。而细胞内的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）能够直接移除这种加合物，是抵消TMZ作用的关键修复蛋白。因此，MGMT的表达水平在很大程度上决定了TMZ的干预效果。尽管MGMT启动子区的甲基化状态已被广泛用作预测TMZ反应性的生物标志物，但大量临床证据表明，仅凭此指标不足以精准预测所有患者的反应，提示存在其他重要的转录及表观遗传调控层面对MGMT进行精细调控，这些机制的阐明对于开发克服耐药的新策略至关重要。

近年来，表观遗传调控在肿瘤耐药中的作用日益凸显。Sirtuin家族作为一类依赖NAD+的去酰化酶，在调控基因表达、代谢适应和应激反应中扮演核心角色。其中，SIRT6主要定位于细胞核，具有去乙酰化酶和去乳酰化酶等多种催化活性，被认为是连接细胞代谢状态与染色质修饰的重要枢纽。其在包括GBM在内的多种肿瘤发生发展中显示出复杂的双重作用，但其在TMZ获得性耐药中的具体功能与机制尚未被系统揭示。本研究即从此科学问题出发，旨在探究SIRT6是否以及如何调控GBM对TMZ的敏感性。

为了模拟临床耐药过程，研究者首先通过长期梯度浓度暴露的方法，从人源胶质母细胞瘤细胞系U87和U251中诱导建立了对应的TMZ耐药细胞系U87R和U251R。通过CCK-8实验量化，耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）相较于亲本细胞显著升高，证实了耐药模型的成功建立。进一步的克隆形成实验和流式细胞术凋亡检测表明，在相同浓度的TMZ作用下，耐药细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应均显著减弱。

在此基础上，研究者系统分析了七个Sirtuin亚型在亲本与耐药细胞中的表达差异。结果显示，SIRT6在两种耐药细胞中的下调最为显著。更为关键的是，通过免疫荧光和细胞核质蛋白分离结合蛋白质印迹分析发现，在亲本细胞中主要定位于细胞核的SIRT6，在耐药细胞中出现了明显的核内减少和胞浆滞留现象。这种SIRT6核定位的丧失在临床样本中也得到了验证：对来自患者的GBM组织进行免疫组化分析显示，与TMZ敏感的患者相比，TMZ耐药患者的肿瘤组织中，细胞核内的SIRT6蛋白水平显著降低。这些发现共同提示，SIRT6，特别是其核内丰度的下降，可能与TMZ耐药表型密切相关。

接下来，研究者在功能层面进行了回复实验。通过在U87R和U251R细胞中过表达SIRT6，成功逆转了细胞对TMZ的耐药性：TMZ的IC50值显著下降，TMZ诱导的克隆形成抑制和细胞凋亡比例显著增加。这表明恢复SIRT6，尤其是其核内功能，能够重新赋予耐药细胞对TMZ的敏感性。

机制探索的第一步聚焦于SIRT6的下游效应分子MGMT。正如预期，耐药细胞中MGMT的蛋白表达水平显著高于亲本细胞。而过表达SIRT6则能有效降低耐药细胞中MGMT的mRNA和蛋白水平。为了确认核定位对SIRT6这一功能的重要性，研究者构建了核定位信号缺失的SIRT6ΔNLS突变体。实验发现，与野生型SIRT6不同，SIRT6ΔNLS无法抑制MGMT的表达，也无法在功能上增强TMZ对耐药细胞的抑制作用。这清晰地证明，SIRT6必须进入细胞核才能发挥其抑制MGMT、逆转耐药的功能。

那么，定位于核内的SIRT6是如何调控MGMT转录的呢？考虑到SIRT6是已知的组蛋白去乙酰化酶，研究者首先检测了可能与MGMT启动子区相关的组蛋白乙酰化修饰（如H3K9ac、H3K56ac），但未发现SIRT6过表达对其有明显影响。研究者将目光转向了SIRT6新近被报道的去乳酰化酶活性。组蛋白乳酰化是一种将代谢物乳酸衍生的乳酰基团共价连接到组蛋白赖氨酸残基上的新型修饰，与基因的激活相关。检测发现，在耐药细胞中，组蛋白H3第9位赖氨酸的乳酰化（H3K9la）水平显著升高。染色质免疫共沉淀实验进一步证实，MGMT启动子区域的H3K9la富集程度在耐药细胞中增强，而过表达SIRT6可以特异性降低该位点的乳酰化水平。同时，耐药细胞内的乳酸水平和乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达也相应升高，外源添加乳酸能直接增加H3K9la水平。临床样本分析也显示，在TMZ耐药患者的肿瘤组织中，H3K9la与MGMT存在明显的共高表达趋势，且与SIRT6的低表达呈负相关。为了确定SIRT6的酶活性是否必要，研究者使用了催化活性失活的SIRT6突变体（SIRT6-mut）。实验表明，只有野生型SIRT6，而非SIRT6ΔNLS或SIRT6-mut，能够同时降低H3K9la和MGMT的表达。这些数据层层递进，完整地勾勒出了“SIRT6核内缺失 → H3K9乳酰化水平升高 → MGMT转录激活 → TMZ耐药”这一全新的表观遗传调控轴。

最后，研究者在体内外模型中验证了靶向此通路的干预潜力。在体外，研究者采用了SIRT6的特异性激动剂MDL-800（该化合物由AbMole提供）进行联合干预实验。MDL-800与TMZ联用，相较于单一化合物处理，能更显著地抑制耐药细胞的克隆形成能力并诱导更大幅度的细胞凋亡。在体内，利用U87R细胞构建的裸鼠皮下移植瘤模型显示，TMZ或MDL-800单用仅能轻微抑制肿瘤生长，而两者联合则能产生显著的协同抑制效应，肿瘤体积和重量增长得到最强力的遏制。对瘤体的免疫组化分析显示，联合干预组中增殖标志物Ki-67的表达最低，同时MGMT蛋白和H3K9la修饰水平也受到最明显的抑制。这些结果从转化医学角度证实，通过药理性激活SIRT6来抑制H3K9la-MGMT轴，是克服GBM中TMZ耐药的有效策略。

综上所述，这项研究系统性地揭示了SIRT6在调控GBM对TMZ敏感性中的核心作用及其分子机制。它首次将代谢产物乳酸、组蛋白乳酰化修饰、MGMT表达以及TMZ耐药串联起来，阐明了SIRT6通过其去乳酰化酶活性，擦除MGMT启动子区的H3K9la激活标记，从而抑制MGMT转录，维持细胞对TMZ敏感性的新通路。这一发现不仅深化了对TMZ耐药表观遗传机制的理解，更重要的是，指出了SIRT6-H3K9la-MGMT轴是一个极具潜力的干预靶点。研究中使用SIRT6激动剂MDL-800（AbMole）在临床前模型中展现出的协同增效作用，为未来开发针对该通路的新型联合干预方案提供了重要的实验依据和方向。未来研究可进一步探索如何优化SIRT6激动剂的递送效率，并联合其他靶向代谢或表观遗传的化合物，以期更有效地攻克GBM的耐药难题。