光漂白后的荧光恢复 (FRAP)

图 1：细胞膜双层上的 FRAP 原理，具有广义顶视图和分子侧视图。 1) 膜被荧光分子(红色)标记。 2) 聚焦激光(绿色)漂白膜的选定区域(黑色)。3) 荧光分子的扩散导致荧光随时间恢复。 D)一段时间后，荧光完全恢复，但总体强度比以前要低。图片来自维基共享资源，Frap 图。

介绍

荧光标记物被特定波长的光激发，然后发出不同波长的光。这使得它们对于科学研究非常有价值，可以定位细胞/蛋白质，甚至随着时间的推移跟踪它们。然而，如果使用非常强的光来激发荧光团，或者荧光团暴露时间过长，荧光分子就会失去发光能力，被称为漂白或光漂白。永久漂白荧光团失去发出荧光的能力，该过程是不可逆的光化学变化。这是成像中的一个大问题，如果荧光团被漂白，它们就不能再充当标记，成像也无法进行。然而，某些技术利用了漂白，其中主要的技术是“光漂白后的荧光恢复”(FRAP)。

FRAP原理

FRAP 是 Axelrod等人开发的一项技术。 (1976)作为研究活细胞中蛋白质流动性的方法。在 FRAP 中，细胞或组织的特定区域被强激光光漂白，从而消除该区域的荧光。该区域通常是细胞膜或发生扩散的区域，例如细胞核，因为 FRAP 需要荧光分子自由移动才能发挥作用。随着漂白的荧光团移出和其他区域的健康荧光团移入，漂白区域的荧光将缓慢恢复，因此称为光漂白后的荧光恢复。该过程如图1所示。

漂白区域的荧光恢复速度与荧光或标记分子的扩散速度成正比，这提供了有关标记分子迁移率的信息(Ishikawa-Ankerhold等人， 2012)。通过漂白细胞内的某个成分或细胞器(例如细胞核)，您可以观察当荧光恢复时分子进出该成分的扩散速率。

FRAP 应用

FRAP 最初是作为一种研究活细胞中蛋白质流动性的方法而开发的，后来发展成为研究分子运输事件(例如扩散、蛋白质动力学或细胞成分之间的相互作用)的流行技术。 FRAP 继续用于蛋白质迁移率和分子扩散研究，但也已发展到包括结合动力学等应用(Groeneweg等人， 2014 年)以及与单分子追踪结合使用(Tran-Ba等人， 2015 年)。 FRAP 的一个例子如图 2所示。

图 2： FRAP 的实际应用示例。图像显示表达 GFP-肌球蛋白 III 的 myo3 细胞。 A) 细胞在漂白前被均匀染色。 B) 选择感兴趣区域 (ROI)，在本例中为细胞核。 C) 高功率激光漂白细胞核，该区域的荧光团不再发光。 D) ROI 中的荧光通过非漂白荧光团的扩散恢复，与 A 相比，荧光总量有所减少。图像来自 Ishikawa-Ankerhold 等人。 (2012)。

FRAP 最初开发的目的是研究细胞膜中的脂质分子，例如它们的运动和组织。当然，FRAP 在生物膜和人造膜的研究、识别配体结合位点和了解细胞转导方面有着广泛的应用。

然而，FRAP 的其他用途已被确定，例如用于研究蛋白质结合，包括蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质运输。这些研究表明哪些配体可以与哪些蛋白质结合，以及结合的速度。通过将 GFP 等荧光蛋白与感兴趣的蛋白质融合，可以研究它们的结合机制，以及从一个细胞区室扩散到另一个细胞区室的能力。这也与膜研究交叉，因为也可以使用 FRAP 观察蛋白质与膜的结合相互作用。

FRAP 还具有膜外的应用，作为研究细胞特定区域内的扩散和结合的强大工具。每个 FRAP 实验都可以漂白许多区域，从而可以收集有关不同细胞类型的特定区域的更复杂的数据。

逆 FRAP (iFRAP)

一些实验使用 FRAP 的反转版本，称为iFRAP。该技术涉及漂白除感兴趣区域之外的整个细胞。由于细胞的更大区域被漂白，iFRAP 是一项相当耗时的技术，但在研究固定细胞内结构内分子的扩散动力学时非常有用。 iFRAP 由 Dundr等人开发。 (2002)，在研究小细胞器中的分子以及它们如何与周围细胞质交换时特别有用。 iFRAP 的一个例子如图 3所示。

图 3：在细胞上进行的 iFRAP 实验。 A) 漂白前的 Cos7 细胞，然后完全漂白，除了以黄色显示的 ROI 外。随着荧光团扩散到细胞质中，这种荧光迅速减弱。比例：10μm。 B) ROI(黑色方块)和相邻区域(白色方块)荧光强度随时间的量化变化。图片来自 Ishihama 等人。 (2008)。

FRAP 问题

虽然 FRAP 是一种灵活的研究技术，但在使用 FRAP 时仍需要考虑一些潜在问题。首先，FRAP 最常用于具有分子扩散能力的活细胞，但这些活细胞也会自行移动，因此很难精确定位和跟踪需要漂白的特定 ROI。此外，这些样本本质上是 3D 的，ROI 焦平面上方和下方的荧光团也会被激光漂白，这意味着漂白区域的形状更像是 3D 圆锥体，而不是 2D 圆形。该漂白锥体的形状根据所用物镜的数值孔径而变化，并且需要考虑到这一点，因为漂白区域形状复杂。

一些荧光蛋白，例如 GFP，能够在暗非荧光状态和荧光状态之间切换，并具有闪烁效果。 GFP 可以独立于漂白激光而处于黑暗状态，并且应该考虑到这一点，因为如果某些分子在漂白时处于黑暗状态，它们可能会重新打开。为了解释 FRAP 的变化，重要的是在同一点上重复 FRAP 作为对照，但这可能具有挑战性，因为每次荧光都较低。

FRAP 相机

FRAP 中最重要的测量是荧光强度。该值开始时很高，降低到接近于零，然后恢复到低于开始时的点。这意味着需要一台灵敏的相机才能准确地跟踪这些强度变化，而具有高信噪比的相机将是定量测量这些变化的理想选择。

此外，由于被成像的事件通常是跨越预定空间的动态扩散事件，合适的相机可以将视野(FOV)缩小到漂白区域和周围细胞，这也将大大提高相机速度并允许跟踪快速分子事件。总体而言，高速、高灵敏度的 sCMOS 相机是 FRAP 的必备条件。

概括

FRAP 是一种多功能生物物理技术，广泛用于研究细胞生物学几乎所有方面的动力学。通过漂白细胞的一部分，可以研究许多因素，包括膜动力学、细胞区室之间的分子扩散，以及不同细胞如何在其之间或内部传递分子信号。凭借精心的实验设计和灵敏的弱光相机，FRAP 是一个可以提供高质量图像和数据的实验平台，是生物物理成像中重要的荧光技术。