Autophagy. | 小核糖核酸病毒 VP2 蛋白通过选择性自噬降解 IKBKE/IKKε 抑制先天免疫

由兰州大学 / 中国农业科学院兰州兽医研究所郑海学研究员、杨帆研究员和朱紫祥研究员为通讯作者2025 年 12 月在 Autophagy 上发表了题为 “Picornavirus VP2 protein suppresses innate immunity through selective autophagic degradation of IKBKE/IKKε” 的研究论文。本研究揭示了小核糖核酸病毒结构蛋白 VP2 抑制宿主先天免疫的新型分子机制，阐明了其通过招募 E3 泛素连接酶 RNF114 促进 IKBKE 的 K33 连接泛素化，进而经 CALCOCO2 介导的选择性自噬降解 IKBKE 的核心功能，且该机制在小核糖核酸病毒中具有保守性。

先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防线，IKBKE 作为先天免疫通路的关键激酶，可磷酸化 IRF3/7 启动 I 型干扰素产生，而小核糖核酸病毒已进化出多种策略逃避免疫监视。选择性自噬是病毒操纵宿主免疫的重要途径，已有研究表明小核糖核酸病毒的非结构蛋白可通过自噬降解免疫分子，但结构蛋白 VP2 在先天免疫调控中的作用尚未明确。

已知小核糖核酸病毒 VP2 参与病毒颗粒组装和入侵，但能否及如何调控自噬与先天免疫的交叉通路仍属未知；IKBKE 常成为病毒靶向的关键分子，但小核糖核酸病毒是否通过自噬降解 IKBKE、其具体调控的泛素化类型及自噬受体尚未阐明。此外，不同小核糖核酸病毒 VP2 的功能是否保守，也缺乏系统研究。本研究聚焦小核糖核酸病毒 VP2 与选择性自噬、先天免疫的互作机制，解析其降解 IKBKE 的分子路径及保守性，为理解病毒免疫逃逸策略提供理论基础。

1. SVA VP2 抑制 I 型 IFN 产生和 ISGs 表达

为探究 SVA 结构蛋白对先天免疫的调控作用，将 SVA VP2 等结构蛋白转染 HEK-293T 和 PK-15 细胞，用 SeV 或 poly (I:C) 激活 I 型 IFN 通路。结果显示，VP2 显著抑制 IFNB 和 ISRE 启动子活性（图 1A-B），且呈剂量依赖性阻断 SeV/poly (I:C) 诱导的 IFNB 启动子激活（图 1C-D）；qPCR 检测发现 VP2 显著降低 IFNB 及 IFIT2、OAS1 等 ISGs 的 mRNA 水平（图 1E-F）。敲低 VP2 后，SVA 对 poly (I:C) 诱导的 ISGs 表达抑制作用减弱（图 1G）。这些表明，SVA VP2 可有效阻断 I 型 IFN 信号通路，抑制宿主抗病毒先天免疫应答。

2. SVA VP2 特异性靶向降解 IKBKE

为明确 VP2 调控 IFN 通路的分子靶点，检测 RLR 通路核心分子表达。WB 结果显示，VP2 仅显著下调 IKBKE 蛋白水平，对 MDA5、RIGI 等其他分子无影响（图 2A）；转染 VP2 可剂量依赖性降解 HA 标签及内源性 IKBKE，不影响 HA-RIGI、HA-IRF3（图 2B-D、S2A-C）。qPCR 证实 VP2 不影响 IKBKE mRNA 表达（图 2E、S2F）；SVA 感染后，IKBKE 蛋白随感染时间逐渐减少，mRNA 无变化（图 2F-G、S2G-H）。这些表明，SVA VP2 在蛋白水平特异性靶向降解 IKBKE，且该效应在人源和猪源细胞中均存在。

3. SVA VP2 与 IKBKE 和 RIGI 相互作用

为验证 VP2 与免疫分子的相互作用，通过 co-IP 实验发现，VP2 可特异性结合 IKBKE 和 RIGI，不与 MDA5、MAVS 等其他分子相互作用（图 2H-I、S2I-K）；SVA 感染时，VP2 与 IKBKE 在细胞质中共定位（图 2K、S2L），且与 RIGI 也存在胞质共定位（图 S2M）。进一步检测显示，VP2 可抑制 TBK1 与 IKBKE、IKBKE 与 IRF3 的相互作用（图 2L-M），但不影响 RIGI 与 MAVS 的结合（图 S2N）。这些表明，VP2 通过与 IKBKE、RIGI 直接相互作用，干扰 I 型 IFN 信号复合物的形成，阻碍信号传导。

4. SVA VP2 通过 CALCOCO2 介导的选择性自噬降解 IKBKE

为阐明 IKBKE 的降解途径，用蛋白酶体抑制剂 MG132、溶酶体抑制剂 CQ/3-MA 处理细胞。结果显示，CQ 和 3-MA 可逆转 VP2 诱导的 IKBKE 降解，MG132 无作用（图 3A）；VP2 可促进 LC3-I 向 LC3-II 转化，增加 LC3 自噬体 形成（图 3B-C、S3A-B）。筛选自噬受体发现，仅 CALCOCO2 可增强 VP2 对 IKBKE 的降解，且 VP2 与 CALCOCO2 在感染时相互作用并共定位（图 3D-F）。CALCOCO2 敲除细胞中，VP2 无法降解 IKBKE，SVA 复制及对 ISGs 的抑制作用均减弱（图 3G-K）。这些表明，VP2 通过 CALCOCO2 介导的选择性自噬降解 IKBKE，促进病毒复制。

5. SVA VP2 增强 IKBKE 的 K33 连接泛素化（K490 位点）

为探究自噬降解的分子标记，检测 IKBKE 的泛素化修饰。结果显示，VP2 可剂量依赖性增强 IKBKE 的总泛素化，且特异性促进 K33 连接泛素化（图 4A-B、S4A），不影响 K63 连接泛素化（图 S4B）。通过赖氨酸突变筛选发现，仅 IKBKE K490R 突变可显著阻断 VP2 诱导的泛素化及降解，其他位点突变无影响（图 4C-D）。这些表明，VP2 通过促进 IKBKE K490 位点的 K33 连接泛素化，为 CALCOCO2 识别提供分子信号，进而介导其自噬降解。

6. RNF114 是介导 IKBKE 泛素化的 E3 连接酶

为筛选介导 IKBKE 泛素化的 E3 连接酶，通过质谱鉴定并验证发现，VP2 可与 RNF114 等互作，且 IKBKE 特异性结合 RNF114（图 5A-B、S5A-B）。RNF114 可降解 IKBKE 并增强 VP2 的降解效应，敲低 RNF114 后，IKBKE 降解受阻（图 5C-D）；RNF114 可促进 IKBKE 的 K33 连接泛素化（图 S5C），VP2 可剂量依赖性增强 IKBKE 与 RNF114 的相互作用（图 5F）。敲低 RNF114 后，SVA 复制及对 ISGs 的抑制作用减弱（图 5G-J）。这些表明，RNF114 是 VP2 介导 IKBKE K33 泛素化的关键 E3 连接酶。

7. VP2 的特定区域和关键残基介导与 IKBKE 的相互作用

为明确 VP2 与 IKBKE 相互作用的结构基础，构建 VP2 缺失突变体发现，aa1-80 和 aa201-284 区域是降解 IKBKE 及抑制 IFN 通路的关键（图 6A-E）；IKBKE 的 ΔPK 和 ΔDDX3X 突变体仍可被 VP2 降解并结合（图 6F-H）。点突变验证显示，IKBKE 的 E148 残基及 VP2 的 C34、D39、T41、R210 残基是相互作用的核心，突变后结合及降解均受阻（图 7A-E）。这些表明，VP2 通过特定功能区域和关键氨基酸残基与 IKBKE 相互作用，介导其降解。

8. 小核糖核酸病毒 VP2 蛋白功能保守

为验证 VP2 功能的保守性，转染 FMDV、EV71 的 VP2。结果显示，三者均能抑制 IFNB 和 ISRE 启动子活性（图 8A）；SVA-VP2、EV71-VP2 在 HEK-293T 中，FMDV-VP2 在 PK-15 中均可降解 IKBKE，且依赖 ATG7/ATG5 及 CALCOCO2（图 8B-I）。序列比对显示，VP2 的关键残基 R210 在三者中高度保守（图 S6）。这些表明，小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白共享 “泛素化 - 选择性自噬” 降解 IKBKE 的保守机制，抑制先天免疫。

9. 自噬对小核糖核酸病毒复制至关重要

为探究自噬在病毒复制中的作用，使用 ATG7、ATG5、CALCOCO2 敲除细胞系感染 SVA、EV71、FMDV。结果显示，敲除后 IKBKE 降解受阻，病毒 3D 蛋白表达、mRNA 转录及病毒滴度均显著降低（图 9A-L、S7A-F）；过表达 VP2 可促进 SVA、FMDV、EV71 的复制（图 S7G-L）。这些表明，小核糖核酸病毒依赖自噬途径降解 IKBKE，解除宿主先天免疫抑制，进而促进自身复制，自噬是其复制的关键支撑。

本研究揭示了小核糖核酸病毒 VP2 蛋白通过选择性自噬降解 IKBKE 以抑制先天免疫的保守机制：VP2 招募 E3 泛素连接酶 RNF114，促进 IKBKE 在 K490 位点发生 K33 连接泛素化修饰，随后被选择性自噬受体 CALCOCO2 识别并转运至自噬体降解，进而阻断 I 型干扰素通路，促进病毒复制；且 SVA、FMDV、EV71 等小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白均具备该功能，证实其保守性。

本研究为开发靶向 VP2-RNF114-CALCOCO2-IKBKE 通路的抗病毒药物提供了新思路，也为优化小核糖核酸病毒溶瘤疗法提供了理论依据，有望为相关疾病治疗开辟新方向。

来源：ZhaoSunLab

编辑：吃一口小猫