基于极端微生物代谢工程与合成生物学的“下一代生物制造技术”

原文发表于《科技导报》2025 年第23 期 《 基于极端微生物代谢工程与合成生物学的“下一代生物制造技术” 》

为实现“双碳”目标，工业生物制造需向绿色可持续转型。高耗水、高灭菌能耗及工艺不连续等瓶颈推动了以极端微生物为核心的下一代生物制造技术的发展。《科技导报》邀请清华大学合成与系统生物学中心、生命科学学院、化工系、绿色生物制造全国重点实验室陈国强教授等撰文，文章综述了盐单胞菌作为核心底盘的应用价值与技术进展，提出了未来需着力开发通用性更强的合成生物学工具，提升规模化发酵过程的稳定性，强化碳源预处理与工艺环节的整合度。

近年来，合成生物学的发展进一步推动了微生物生物制造在多样化产品生产中的应用研究，并引领了下一代技术的探索。相较于常规微生物底盘，极端微生物凭借其在严苛环境中突出的生长能力，展现出显著的抗染菌、可连续过程和低成本的生产潜力，尤其适用于大规模发酵生产各种生物产品（表1）。基于极端微生物代谢工程与合成生物学改造的下一代生物制造技术，不仅有望显著简化工艺过程，支撑以低成本原料为底物、无需灭菌的开放式连续发酵，更进一步彰显了其成为可持续制造领域核心绿色解决方案的潜力。

表1 极端微生物在严苛环境中突出的生长能力及其应用

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极端微生物开启生物制造新时代

1.1 生物制造代际跃迁的需求

利用微生物作为“细胞工厂”的生物制造技术，凭借其环境友好特性，正日益成为生产多样化的化学品的重要替代方案，并受到广泛关注。得益于合成生物学的快速发展，生物制造在生物燃料、生物材料、食品添加剂等多种化学品生产领域已展现出与传统制造相当的竞争力，呈现出未来替代传统石油基生产路径的趋势。

然而，以常规微生物及各类酵母为基础的当前工业生物技术（CIB），其规模化应用仍受限于几个关键瓶颈：为防控杂菌污染所必需的高能耗灭菌过程、难以实现连续化生产导致效率低下，以及由此带来的成本竞争力不足。

为突破这些限制，以极端微生物为底盘菌株的下一代生物制造（NGIB）应运而生。这一策略显著降低了灭菌能耗、简化了操作流程（尤其是淡水资源的消耗），并提高了生产的连续性。得益于针对此类极端微生物开发的遗传操作工具箱，NGIB平台已成功用于高效合成多种产品。

1.2 极端微生物的工业价值潜力

极端微生物指能够在高盐度、极端pH值、高温或高压等恶劣环境中生存的微生物，主要为原核细菌和古菌。根据其耐受的主要环境条件，它们被命名为嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌、嗜热菌和嗜旱菌等。部分菌株甚至具备多重环境耐受性（表1）。目前，极端微生物的应用主要集中于嗜热菌（生长温度>50℃）、嗜酸碱菌和嗜盐菌这3大类群，呈现“三足鼎立”之势。其中：

• 嗜热菌因其高温生长特性，在发酵过程中可显著节省冷却成本并有效防止杂菌污染。

• 嗜酸碱菌在极端pH值条件下生长具有天然的抗杂菌污染优势。

• 嗜盐菌的高盐适应性使其在开放培养体系中大幅减少灭菌需求，有效降低生产成本，因此在可持续生物制造领域备受关注。

02

基于盐单胞菌开发的“下一代工业生物技术”

盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01分离自新疆艾丁湖，是一株可天然合成生物聚酯PHB的嗜盐菌。显著优势有：

• 耐受高盐高碱环境，抗杂菌污染能力强；

• 其野生型菌株在优化的葡萄糖矿物质培养基中可高效积累PHB；

• 且细胞壁在低渗条件下易破裂，便于下游产物提取。

2.1 基因工程

在遗传操作的核心工具方面，盐单胞菌主要依赖3类载体系统：基于标准欧洲载体架构（SEVA）的pSEVA系列载体、经改造的pRE112−pMB1载体，以及基于天然毒素−抗毒素模块构建的无抗生素表达系统pHbPBC。调控基因表达的关键在于启动子工程，该菌株中已成功开发出多种启动子工具。特别值得指出的是，强效的低氧诱导启动子Pvgb及其工程化串联版本P8vgb，显著提升了该菌在微好氧条件下生产多种生物聚酯PHA的能力。核糖体结合位点（RBS）的优化则借助在线计算工具和RNA测序（RNA−seq）技术实现，而终止子工程则开发了高效的不依赖Rho因子的终止子。

基因组编辑技术的进步极大推动了代谢途径的精准改造。在该菌中，编辑策略已从早期基于I−SceI内切酶介导的双交换，发展至高效的CRISPR系统应用，基于小分子RNA（sRNA，如 PrrF1−2−HfqPa）的调控系统也能有效下调靶基因，显著改变产物的组成。提升遗传转化效率是重要挑战，利用大肠杆菌S17−1进行接合转移是常用方法。

适应性进化是增强宿主性能的有效策略。尽管传统蛋白质定向进化在盐单胞菌中应用有限，近期开发的革命性正交转录突变系统（OTM）融合了噬菌体RNA聚合酶和脱氨酶功能，实现了超快速（1 天）、高效率（突变率提升150万倍）的体内蛋白质进化，为未来代谢途径的深度优化开辟了新途径（表2）。

综上所述，基于盐单胞菌所开发的技术已发展出一套综合体系，集成了精细的遗传元件设计、多样化的基因组编辑工具以及高效的宿主进化策略（图1）。

表2 基于盐单胞菌所开发的技术

图1 基于盐单胞菌所开发的技术

2.2 代谢工程

代谢流调控是极端微生物代谢工程的核心挑战。因此，除了传统的筛选、工程化与优化策略，还需要协同开发多种代谢工程方法，以强化目标产物的代谢通量，提升盐单胞菌在生物制造中的产出。优化细胞形态是提高产物积累的有效策略。在盐单胞菌中，通过基因工程扩大细胞体积已被证实能有效促进PHA的积累。此外，更为精细的调控策略也已开发，例如改造ClpXP蛋白降解系统，实现了对目标蛋白（如MreB）降解速率的动态、可调控降解，为精确控制细胞形态提供了新工具。

革兰氏阴性菌的外膜结构在维持细胞完整性、降低通透性方面构成关键屏障。这些工程菌株表现出增强的细胞通透性，这不仅提高了异丙基−β−D−硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的灵敏度，还增强了菌株在低氧条件下的适应性，增加了对抗生素的敏感性，改善了胞内氧气摄取效率，并促进了相容性溶质四氢嘧啶的外泌。更重要的是，这些改造显著提升了细胞干重、PHA含量以及PHA的转化效率。最近，为降低PHA下游提取成本，在不同工程化的H. bluephagenesis菌株中应用了胞外多糖（EPS）缺陷策略，通过删除特定的EPS合成基因片段（如PS1、PS2和PS4）。利用这些EPS敲除细胞进行发酵，有效减少了底物消耗，降低了能量需求，并显著简化了下游提取流程。

细胞内氧化还原环境的平衡是影响代谢物（尤其是PHA）高效积累的另一个决定性因素。为了在限氧条件下提升NADH/NAD+比值并促进PHA积累，可以靶向调节电子传递链。这一氧化还原工程策略使细胞干重中的PHB含量达到了90%，显著超越了野生型菌株84%的PHA含量。利用外源添加乙酸来平衡NADH/NAD+比值也被证明是有效的策略。氧化还原平衡策略同样适用于其他高附加值化学品的生产。

创新性调控系统的开发极大地推动了PHA生产的自动化和经济性。通过对H. bluephagenesis TD菌株进行代谢工程改造，开发了一种基于PHA合成相关蛋白PhaR和PhaP1的自诱导表达系统。该策略构建了一个“自激励”的生产系统，能够在无需添加昂贵外源诱导剂（如IPTG）的条件下实现PHB的高效合成。深入研究表明，PhaR蛋白在这一过程中扮演着核心调控角色。这种精妙的自我调控机制显著提高了PHA产量，并简化了生产工艺，大幅降低了成本。为了进一步解决PHA生产中下游提取成本高昂的瓶颈问题，在盐单胞菌中成功构建了一套智能自裂解系统。该系统首创性地使用PHA感应型的PhaP1启动子进行调控，自动触发裂解基因的表达。同时，通过优化裂解基因前的RBS，最大限度地减少其对宿主细胞PHA合成能力的干扰。这些突破性进展为PHA的工业化生产尤其是提纯带来了显著的经济效益。

综上所述，通过对极端微生物盐单胞菌进行多层次的工程改造，以及开发智能的自诱导和自裂解系统，这些工作成功开发出一系列具有显著工业应用价值的下一代生物制造技术方案。这些系统性工程策略有效克服了PHA生产成本高昂的障碍，极大地推动了PHA生物可降解材料的商业化进程，充分展示了极端微生物代谢工程在可持续生物制造领域的广阔应用前景。

03

基于盐单胞菌的生物制造应用开发

3.1 盐单胞菌生产PHA和小分子化合物

盐单胞菌能够高效合成2类关键产品：生物可降解材料PHA及多种高附加值化学品，为可持续工业生物技术提供了独特平台（图2）。

在生物材料领域，PHA作为胞内积累的聚酯，因其优异的生物相容性、可降解性及材料可塑性，被视为石油基塑料的绿色替代品。盐单胞菌天然具备PHA合成能力，通过代谢工程强化，整合外源phaAB基因可使PHB产量提升至细胞干重的76%。更重要的是，菌株改造已突破均聚物限制，成功生产含3−羟基丙酸（3HP）、4−羟基丁酸（4HB）、5−羟基戊酸（5HV）等单体的共聚物，显著拓展材料性能谱。为降低生产成本，工程策略聚焦底物多元化：利用淀粉、木质纤维素水解物、餐厨废料水解物等廉价碳源，并通过途径重定向实现葡萄糖至PHA共聚物P(3HB−co−4HB)的直接合成。200-400立方米生物反应器规模化生产验证了其工业可行性。

图2 用于生产多种生物制品的嗜盐微生物细胞工厂的设计

高值化学品的生物合成是盐单胞菌另一核心应用方向。氨基酸类产物中，四氢嘧啶作为高端化妆品与医药原料，在H. bluephagenesis中实现与PHB联产。有机酸领域亮点突出：3−羟基丙酸（3HP）产量达154 g/L，衣康酸作为可再生平台化学品通过全细胞催化实现高效转化，甲羟戊酸（MVA）作为类异戊二烯前体产量达121 g/L。此外，γ−氨基丁酸（GABA）通过全细胞催化实现880 g/L超高产量，凸显其生物催化潜力。

盐单胞菌在蛋白质生产领域同样展现独特价值，其胞内积累的四氢嘧啶可稳定蛋白质构象，而天然分泌系统支持重组酶表达。此外，该菌属作为嗜盐酶资源库，提供耐极端条件的水解酶与氧化还原酶，适用于制药、食品工业。

创新应用方向正在拓展：PHA可酯化为生物燃料（如R−3−羟基丁酸甲酯），而H. bluephagenesis已实现丙烷、PHB与扁桃酸酯联产。色素生产方面，工程化H. elongata的β−胡萝卜素产量达560μg/g干重。

综上所述，盐单胞菌通过多层次代谢工程，已发展成为兼具“生物材料工厂”与“高值化学品合成平台”双重功能的超级微生物底盘（图2）。其在开放连续发酵、底物广谱利用及产品多元联产方面的独特优势，为降低生物制造成本、推动循环经济提供了关键技术支撑。

3.2 盐单胞菌的废弃物资源化利用

盐单胞菌通常以葡萄糖为主要碳源，但部分菌株可天然利用非常规底物。然而，工业潜力突出的菌株因缺乏胞外酶分泌能力，难以利用复杂底物，需通过代谢工程改造解决。

针对淀粉利用，研究者改造H. bluephagenesis使其分泌淀粉酶和葡萄糖苷酶，成功以玉米淀粉为碳源合成PHA、PHB、PHBV、P34HB及四氢嘧啶等产物，摇瓶中细胞干重（CDW）达10 g/L，PHB含量占51%。木质纤维素水解产物木糖的利用亦获突破：通过引入木糖转运蛋白、异构酶及磷酸酮醇酶途径，工程化H. bluephagenesis的PHB产量提升至5.37 g/L（CDW 8.81 g/L）。

餐厨垃圾的资源化利用是另一重点。工程化H. bluephagenesis在细胞外膜合成基因ompW启动子驱动下过表达PHA操纵子，以富氮食物垃圾水解液为原料，在7−L生物反应器中CDW达70 g/L，PHB含量占80%。针对低成本底物乙酸，通过适应性实验室进化获得耐受性菌株H. bluephagenesis B71，进一步引入甲羟戊酸途径并结合非氧化糖酵解设计，使MVA产量达121 g/L。

CO2固定技术为碳中和提供新思路。值得注意的是，部分盐单胞菌（例如H. rowanensis）通过还原性三羧酸（rTCA）循环而非卡尔文循环实现化能自养，以硫代硫酸根为能源，其独特CO2同化机制的阐明将对工业应用产生深远影响。

04

“下一代生物制造技术”的产业实践

NGIB作为当前工业生物技术的重大升级与创新方向，其核心优势在于利用极端微生物（如盐单胞菌）作为底盘细胞进行生物制造。这些微生物能在高盐等极端环境下生长，从根本上消除了传统发酵过程中复杂且高能耗的灭菌步骤需求，实现了开放发酵。这一特性赋予了NGIB显著的优势：高底物转化率、低能耗、节水以及环境友好性（因其产生的废水量少且可回收利用）。此外，通过工程技术（如增大细菌体积或调整表面电荷）诱导微生物发生自絮凝沉降，NGIB极大地简化了产物的下游分离纯化过程（图3）。

图3 基于盐单胞菌的下一代工业生物技术流程

NGIB技术已成功应用于多种高价值产品的生产，特别是生物可降解材料PHA以及各类精细化学品。随着合成生物学工具的快速发展及其在盐单胞菌工程化中的应用，NGIB的优势不断被强化和完善，并已在中国实现工业化。其中，微构工场专注于工业发酵，尤其是在PHA生产和盐单胞菌应用方面处于国际前沿，已成功建成全球首个万吨级PHA生产线。为进一步扩大规模，微构工场与安琪酵母（Angel Yeast）合作建立合资企业，产品线涵盖PHA颗粒、吸管、注塑餐具、淋膜纸杯、3D打印材料和医药中间体等多元化终端应用（图4）。综上所述，凭借其高效、节能、节水和环境友好的核心特点，NGIB正迅速发展成为工业生物技术领域至关重要的未来方向。

图4 国内部分PHA企业发展历程

05

结论

极端微生物特别是盐单胞菌，正成为下一代生物制造的重要生产平台。这类微生物具有独特的环境适应能力，其强大的抗污染特性尤为突出，使得在开放环境下进行非灭菌发酵成为可能，显著降低了生产能耗与成本。

未来突破需系统整合前沿技术、智能装备与政策支持。技术层面亟需开发高效菌种筛选技术，构建跨物种基因表达载体，优化CRISPR等基因编辑工具的多位点编辑能力，建立从基因序列到生理功能的预测模型，设计耐受严酷环境的遗传元件，并统一代谢分析标准。产业实施路径应包含：建立代谢模型指导产物合成路线设计，拓展工农业废弃物等替代原料的应用，采用智能生物反应器实现精准工艺调控。依托中国“双碳”政策支持，通过发展循环经济模式推进废弃物资源化利用，构建完整产业生态链。随着关键技术瓶颈的突破与产业生态的成熟，基于极端微生物的下一代生物制造技术将在全球绿色制造体系中发挥重要作用，为可持续发展提供关键技术支撑。

本文作者：陈江楠、陈国强

作者简介：陈江楠，清华大学生命科学学院，博士研究生，研究方向为合成生物学；陈国强（通信作者），清华大学生命科学学院，清华大学化学工程系，清华大学合成与系统生物学中心，清华北大生命中心，绿色生物制造全国重点实验室，教授，研究方向为工业生物技术、微生物聚羟基脂肪酸酯的合成与应用。

文章来 源 ： 陈江楠, 陈国强. 基于极端微生物代谢工程与合成生物学的“下一代生物制造技术”[J]. 科技导报, 2025, 43(23): 70−82 .

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