Sci Adv丨阮建彬课题组揭示LPS驱动非经典炎症小体组装及激活的分子机制

细胞焦亡（ Pyroptosis ）是一种炎症性细胞死亡 , 深度参与感染免疫、肿瘤免疫及炎症性疾病。 细胞焦亡过程由炎症小体信号通路介导完成，炎症小体信号通路又可以分为两种：经典炎症小体信号通路和非经典炎症小体信号通路【1】。当细胞感受到细胞 内 的 PAMPS （病原体 - 相关的模式分子）或者 DAMPS （损伤 - 相关的模式分子）时，炎症小体信号通路被触发。在经典的炎症小体信号通路中，信号的起始源于胞质模式识别受体（ PRRs ）的寡聚化，这些受体包括含有核苷酸结合结构域（ NBD ）和富亮氨酸重复序列（ LRR ）的 NLR 家族蛋白，或黑色素瘤缺失因子 2 （ AIM2 ）样受体等，组装后的受体诱发招募配体 ASC 蛋白以及 caspase-1 蛋白形成多聚蛋白质复合物， c aspase-1 会被激活，激活的 caspase-1 一方面切割形促炎性细胞因子前体（ pro-IL-1β 和 pro-IL-18 ）使其活化，另一方面介导切割 GSDMD 蛋白形成氨基端和羧基端端结构域分子，氨基端分子随后能够能够在细胞膜上形成孔状结构，介导 IL-1β 等细胞因子的释放，细胞会进一步发生肿胀和最终破裂 ，细胞焦亡发生【1-2】。

非经典炎症小体信号通路是一种非 caspase-1 依赖的信号通路， 细胞感知革兰氏阴性菌感染释放的脂多糖（ LPS ），小鼠 caspase-11 及其人类同源物 caspase-4 和 caspase-5 通过其氨基端的半胱天冬酶激活与募集结构域（ CARDs ）与 LPS 结合，随后发生寡聚化并被激活， 激活后的 caspase-4/5/11 同样能够切割 GSDMD ，进而引发后续过程。 非经典炎症小体的过度激活与脓毒症的发生、发展及预后密切相关【2】。 然而， LPS 结合 并 驱动 caspase-4/11 组装 及激活 的分子机制 仍不清楚 ，是领域里重要的科学问题之一 。

2026 年 1 月 1 日，康涅狄格大学健康中心 免疫系阮建彬课题组在 Science Advances 杂志上发表文章

LPS-induced structural reorganization and polymerization drive noncanonical inflammasome activation

LPS 的酰基链数目决定 caspase-4/11 的 CARD 寡聚化

前期的研究 显示 ，六酰基化的 LPS （如 LPS-Ra ， 一种不含 O- antigen 的 大肠杆菌脂多糖 变体 ）可通过诱导寡聚化来激活 caspase-4/11 ，而低酰基的脂多糖拮抗剂（如四酰化的 LPS 前体 lipid I V a ）则不能激活 caspase-4/11 的活性。研究者推测脂多糖的酰基化程度决定了 caspase-4/11 是否发生寡聚化并 激活 其活性。 实验表明， 从昆虫细胞中纯化出的 caspase-4 活性 caspase-11 呈现单体状态，当结合六酰基化的 LPS-Ra 后，其 聚集 状态更接近一个八聚体，而与 Lipid I V a 结合后则提示 复合物呈现更小的寡聚体状态。

鉴于 LPS 分子中的 lipid A 部分在不同 革兰斯 细菌物种之间存在差异，不仅体现在酰基链数量上，还包括链长和支化等其他结构特征，因此研究者将分析范围从大肠杆菌（ E. coli ） 扩展到其他革兰氏阴性菌的 LPS ，包括 沙门氏菌 、 铜绿假单胞菌 以及 牙龈卟啉单胞菌 。这些细菌的 lipid A 部分具有化学性质相近的骨架结构，但其酰化模式各不相同。实验结果表明（图1）， caspase-4 和 caspase-11 均可被含有 ≥6 条酰基链 的 LPS 物种有效激活（如 大肠杆菌、 沙门氏菌和铜绿假单胞菌 LPS ），而酰基链数少于 6 的 LPS （如 P. gingivalis 和 R. sphaeroides ）则无法诱导 caspase-4 或 caspase-11 的激活。此外，七酰化的沙门氏菌 LPS 所诱导形成的 caspase-4/11 CARD 寡聚体，其分子量与六酰化的大肠杆菌 LPS-Ra 所诱导的寡聚体相当。

图1: 各种 细菌中不同酰基化程度的脂多糖激活caspase-4/11的 能力差异。

这些结果表明，LPS的酰基链数目是决定caspase-4/11的CARD寡聚化及其激活状态的关键因素。含有六条或更多酰基链的LPS物种可促进形成更高阶的组装体（很可能为八聚体），从而具备激活非经典炎性小体的能力；而酰基链数较少的LPS则倾向于形成不完全的寡聚体，在所测试的条件下不具备活性。

LPS 配体诱导 caspase-4/11 的 CARD 发生结构重排

研究者在 近 期 另一项 研究 中 ，报道了 LPS 结合 会 增加全长 caspase-11 的 α- 螺旋 比例并 诱导其结构变化【3】。为了进一步评估这种结构转变是否归因于 CARD 结构域 ， 作者 获取 caspase-4 和 caspase-11 CARD 蛋白 ， 利用 圆二色谱（ circular dichroism ， CD ）分析 其 在有或无配体 LPS-Ra 与 LPS-Rs 存在的情况下 二级结构分布情况 。 结果表明， 在无配体条件下， caspase-4 CARD 的 CD 光谱在 210 nm 以上没有明显峰值，表明其主要呈无序构象。与 LPS-Ra 孵育后， caspase-4 CARD 转变为以 α- 螺旋为主的二级结构。 LPS-Rs 可促进较小且无活性的 caspase-4 寡聚体组装，其同样诱导了类似的结构转变。 caspase-11 CARD 也显示了类似的配体诱导结构转变。

综合来看，这些结果支持这样一个模型：caspase-4和caspase-11的CARD在静息状态下本质上是无序的，但在LPS结合时发生α-螺旋结构转变，从而促进寡聚化并触发后续激活。

CARD 的高阶组装对于其 活性 激活是必需的

为了精确研究 caspase-4/11 在 LPS 结合后的寡聚状态， 研究者 使用 非变性 质谱（ native mass spectrometry ， nMS ）监测 caspase-11 CARD 在有无 LPS-Ra 或 lipid IVa 条件下的组装情况。 结果显示， 在无 LPS 结合时， caspase-11 CARD 解析 的分子量 显示 其主要以 单体形式存在 ；与 LPS-Ra 孵育后，复合物 峰位于 高分子量区域， 主要 分布在 在 400–520 kDa 范围内，进一步质谱数据解析表明，复合物主要形成八聚体，每个 CARD 单体平均结合约 2–3 个 LPS-Ra 分子。 与 lipid IVa 孵育的 caspase-11 CARD 非变性质谱数据分析显示 ，该复合物显示出与 LPS-Ra 复合物类似的宽峰重叠特征，但质荷比（ m/z ）范围明显较低 ， 主要分子量约为 236.6 kDa ，约为 CARD/LPS-Ra 复合物的一半。这些结果提示，当结合四酰基 lipid IVa 时， caspase-11 CARD 更可能形成四聚体，而非八聚体或更高阶的寡聚体。进一步 进行 质谱光度（ mass photometry ）分析 ， 其结果与 与 nMS 分析 结果一致 。

以上 分析 表 明， caspase-4/11 的寡聚状态是非经典炎症小体激活的关键决定因素。六酰基 LPS 激动剂可促进形成高阶 caspase-4/11 CARD 寡聚体（如八聚体），而五酰基或四酰基拮抗剂（如 lipid IVa ）仅诱导较小且无活性的 复合物 组装 （如四聚体） 。

C aspase-4/11 CARD 通过 疏水性口袋 结合 LPS

该课题组 近期的研究发现， caspase-11 的 CARD 可与多种脂质分子相互作用，这些脂质具有一种保守的结构特征，即至少含有 14 个碳原子的酰基链 3 。这一观察结果促使 其 提出假设：在 CARD 内部存在一个特定的结构模块，负责识别 LPS 的酰基链。为验证这一假设， 其采用 采用了氢 - 氘交换质谱（ HDX-MS ）技术，通过测量主链酰胺氢的交换速率来评估蛋白质的构象动态性，从而提供关于溶剂可及性和结构保护程度的重要信息。

基于大肠杆菌中纯化所得的 Caspase-11 CARD 在利用去垢剂去除结合的脂多糖后仍保持有序的 寡 聚状态，因此利用该纯化所得蛋白，比较其在有无 LPS 条件下的 HDX 图谱，可帮助 直接 鉴定 LPS 结合至关重要的结构元件或关键残基。 HDX-MS 数据显示 ，在无 LPS 结合状态下， caspase-11 CARD 第 25–37 位残基表现出快速的氘摄取，而第 4–22 位残基在时间依赖性分析中显示出显著升高的氘摄取，提示这些区域具有高度动态性并暴露于溶剂中。在与 LPS-Ra 结合后，这两个区域的氘摄取均显著降低，表明它们受到结构保护，很可能直接参与了与 LPS-Ra 的相互作用。第 78–91 位残基在有无 LPS-Ra 存在的情况下均表现出较高的氘摄取速率 ， 提示该区域无论是否结合 LPS ，始终处于溶剂暴露且结构较为柔性的状态。这一结果与先前研究一致，即 caspase-11 的 N 端前 80 个残基已足以介导 LPS 结合。 此外，研究者之前的研究表明， PGPC 作为近期鉴定的一种内源性氧化磷脂，可抑制 caspase-11 的活性。 与 LPS-Ra 类似， PGPC 结合后同样降低了第 4–22 位和 25–37 位残基的氘摄取，表明 PGPC 很可能与 CARD 内 同一疏水口袋结合。这一共享的结合位点可能解释了 PGPC 拮抗 LPS 诱导的 caspase-11 寡 聚化与激活的能力。

对 该两个区域的氨基酸 残基的序列分析显示，该区域包含多个疏水性残基，并且在不同物种中的 caspase-4 、 caspase-5 和 caspase-11 之间高度保守。利用 AlphaFold 进行的结构建模预测， 该区域 残基在 caspase-11 CARD 中形成 α1 和 α2 两条螺旋 ，其中的 疏水性残基共同构成了一个巨大的疏水口袋。该口袋还涉及由第 66–78 位残基形成的 α5 螺旋，最终形成的疏水口袋长度约 20 Å 、宽约 14 Å 、深约 8 Å ，体积足以容纳多达四条 LPS 的酰基链 ，针对该区域的疏水氨基酸进行 亲水突变分析，相关突变体则呈现单体状态或单体与寡聚体的混合状态，表明其 LPS 结合能力受损、寡聚化过程被破坏 。 值得注意的是， 尽管其中部分疏水残基在 caspase-1 CARD 中也具有保守性，但在该背景下并未形成类似的口袋结构，提示这一结构特征特异存在于非经典炎性半胱天冬酶 caspase-4 和 caspase-11 中。

综上，可以得出结论：由第4–37位残基及α5螺旋相关残基共同形成的疏水口袋，是介导caspase-4/11与LPS及其他脂质配体相互作用的关键结构元件。

多个相互作用界面 介导 caspase-4/11 CARD 寡聚化

为探究 caspase-4/11 在激活过程中 介导 寡聚化的 相互作用界面 ， 作者 利用 单残基分辨率的交联质谱（ XL-MS ）方法 进行分析，即 利用化学交联剂捕获由 LPS 诱导形成的 caspase-11 CARD 寡聚体中特异性接触 界面附近的赖氨酸残基 。 通过对 caspase-11 CARD 的寡聚体和突变单体进行质谱数据对比分析，作者共鉴定出 K9–K62 及 K44–K64 和 K38–K67 等多个亚基间交联肽段 ，提示该些氨基酸及其周围区域构成了 caspase-11 寡聚化过程中 CARD-CARD 相互作用界面。 针对该几个区域的相关氨基酸残基进行突变， caspase-11 CARD 寡聚化被破坏或者削弱。 随后， 研究者 采用类似的方法研究了 caspase-4 CARD 的寡聚化机制 ， 在 caspase-4 CARD/LPS-Ra 复合物中检测到涉及 K8/9–K53/K64 、 K9–K49 以及 K49–K64 的交联，这些对应于在 caspase-11 CARD 中观察到的 K9–K62 和 K44–K64 亚基间交联。而与 K38–K67 对应的交联在 caspase-4 CARD 中未被检测到，可能是由于对应区域缺乏赖氨酸残基。综上，我们的 XL-MS 数据证实了 LPS 结合后 caspase-4/11 CARD 寡聚体的形成，并鉴定了可能介导 CARD–CARD 寡聚化的潜在相互作用界面 ，这些界面在 caspase-4 和 caspase-11 里面高度保守。

总结

C aspase-4/11 非经典炎性小体仅由一种蛋白组成，并同时兼具受体和效应器功能。 CARD 是一种研究较为深入的蛋白模块，在多种细胞死亡通路（包括焦亡、程序性坏死和凋亡）中发挥关键作用。迄今为止，已鉴定出数百种 CARD 或含 CARD 的蛋白，其中大多数作为蛋白 – 蛋白相互作用模块，介导信号体的组装及下游信号转导 ， 为促进此类信号体的形成，许多 CARD 已知可组装成丝状结构 。 本研究 表明 ， caspase-4/11 的 CARD 在与六酰化 LPS 结合后发生高阶寡聚化，形成八聚体复合物，这很可能代表非经典炎性小体激活所需的最小功能单元。 尽管 caspase-4/11 CARD 与其他 CARD 具有较高的序列相似性，它们却形成了一种结构上明显不同的组装方式，并未观察到丝状结构的形成。通过 XL-MS ，在 caspase-4/11 CARD 寡聚体中鉴定出若干潜在的亚基间交联区域，这些潜在接触 面 并未完全保留 caspase-1 CARD 寡聚体中已知的 I/II/III 型界面，提示 caspase-4/11 CARD 采用了一种独特的组装机制。相关 数据支持一种潜在的相互作用模型：单个 caspase-4/11 CARD 的疏水口袋可能不足以容纳一个 LPS 分子的全部酰基链， LPS 的结合由多个 CARD 协同完成，一个 LPS 分子的酰基链可同时与多个 CARD 相互作用。 LPS 作为一种 脂质 支架或 “ 分子胶水 ” ，将多个 CARD 聚集在一起，从而促进寡聚化。

总之， 该 研究揭示了一种不同于经典丝状 CARD 寡聚体的、由脂 多糖 驱 动的组装机制，为理解非经典炎性小体的脂质特异性激活提供了理论框架 。 C aspase-4/11 CARD 如何在分子层面识别酰基链并发生寡聚化，其精确机制仍有待阐明 ， 解决这些问题将需要对 caspase-4/11 CARD 与不同 LPS 物种形成的复合物开展高分辨率结构 生物学 研究。

康涅狄格大学健康中心免疫系阮建彬教授为本文的通讯作者，汪成亮博士、 Philip Lacey 博士以及田甜博士为论文的共同第一作者，该系 Vijay A. Rathinam 教授 与俄亥俄州立大学 Vicki H. Wysocki 教授及其课题组成员作为主要贡献人参与了该课题研究。

康涅狄格大学健康中心阮建彬教授课题组招聘：阮建彬教授课题组一直围绕天然免疫信号通路以及病原体引起的免疫应答分子机制进行研究，旨在为相关感染性疾病譬如脓毒症（ Sepsis ）、癌症及自身免疫性疾病等探索新的药物靶点，提供新的治疗策略。阮建彬博士在天然免疫领域取得一系列原创性成果，发表高水平研究论文 4 0 余篇，其中以第一或者通讯作者在 Nature(4 篇 ) 、 Cell 、 Science Advance s 、 EMBO Journal 等杂志发表论文 等 10 余篇，以共同作者在 Nature 、 Science 、 Cell 、 Nature Immunology 等杂志发表论文 20 余篇，他引 >11,000 余次。 欢迎 有理想、有兴趣的研究生或者博士 后 加入这支年轻、敢于挑战的团队。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adz4623

制版人： 十一

参考文献

1. Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation.Nat Rev Immunol20, 143-157, doi:10.1038/s41577-019-0228-2 (2020).

2. Shi, J., Zhao, Y., Wang, K., Shi, X., Wang, Y., Huang, H., Zhuang, Y., Cai,T., Wang, F., and Shao, F. (2015). Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.Nature526, 660–665.

3. A. B. Cao, P. Devant, C. Wang, M. Sun, S. N. Kennedy, W. Ma, J. Ruan, J. C. Kagan, LPS binding caspase activation and recruitment domains (CARDs) are bipartite lipid binding modules.Sci. Adv. 11, eadt9027 (2025).

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