非啮齿类动物毒性研究中死亡/濒死原因判定的考量要点

在药物的非临床安全性评价中，未预期的动物死亡时有发生，其原因可能与供试品相关，也可能无关（如饲养、操作因素或背景/群体地方性疾病）。随着化学品、药物、食品添加剂研究监管法规的出台，明确要求若无法通过临床症状和宏观评估确定死因（COD），需对按计划完成研究的动物进行组织病理学评估，以查明死亡原因；同时，动物福利法规也要求尝试明确导致严重反应或死亡的原因。

非啮齿类动物死因（CODN）工作组是美国毒理学病理学会（STP）科学与监管政策委员会（SRPC）下属机构。致力于了解制药行业、学术机构、CRO在GLP与非GLP毒性研究中，针对主要非啮齿类动物（以非人灵长类动物、犬为主，兼顾兔、猪等）开展早期/计划外尸检时，“死因（COD）”或“濒死状态”的判定与报告现状及预期要求。负责制定“考量要点”，指导研究中计划外尸检相关数据的收集、评估与报告，帮助病理学家、毒理学家及监管机构明确“受试物相关死因”与“偶发死因”的区别。

2022年末-2023年初STP开展了一项调研：向行业发放调查问卷，收集非啮齿类动物（主要为NHP、犬，也含啮齿类及兔等其他非啮齿类）“濒死动物计划外安乐死”与“发现已死亡动物”的死因判定实践信息（两类场景统称“COD”），其中“COD”定义为“研究中计划终止前死亡或被安乐死动物的临终死亡原因”。评估不同物种在死因判定方法与成功率上的潜在差异。死因判定依据：通常由研究病理学家综合所有可用研究数据判定，包括动物病史、兽医学相关子学科信息（临床兽医评估、尸检观察、临床与解剖病理样本评估、微生物评估）及受试物暴露数据，但不同物种、机构、研究类型对评估的预期与范围存在差异。

本文阐述2022年末-2023年初行业调研结果，提出非啮齿类动物COD判定与报告的“考量要点”，以助力合理评估其与“人类潜在暴露受试物”的关联性。

监管框架发展史

在1938年美国《联邦食品、药品和化妆品法案》出台前，监管机构并未参与动物研究的规划或实施。该法案的出台，源于一系列公共卫生灾难，如20世纪30年代的磺胺类药物酏剂灾难和60年代初的沙利度胺灾难。

美国FDA于1949年首次发布的面向行业的食品中化学物质毒性评估指南，被称为“黑皮书”。此后，更多毒性评估标准化方案相继出台，OECD于1981年发布了相关方案，这些方案随后也被纳入1982年版《FDA红皮书》。

1996年，ICH发布了一系列指南，旨在确保以资源利用效率最高、质量最优的方式研发、注册和维护安全、有效且高质量的药品。

目前，包括ICH M3(R2)指南在内的ICH系列指南，为早期非临床研究中确定最大耐受剂量（MTD）提供了明确指导，其目的是为关键非临床研究的剂量设定提供依据。该指南指出，合理选择剂量的目的是论证并明确毒性特征，同时尽量避免研究过程中动物过早死亡。然而，对于一般毒性研究中确定死亡原因的具体要求，相关指导意见仍较为有限。

《2000年FDA红皮书：IV.B.4毒性研究中的统计学考量》建议，需记录每只动物的死亡类型（计划处死、濒死、发现死亡）、死亡日期、研究参与天数，以及动物被移出研究的所有原因。ICH M4S—安全性部分指出，在涉及死亡原因时，“应评估毒性反应的发生时间、严重程度、持续时间、剂量相关性、可逆性（或不可逆性）程度，以及种属或性别相关差异，并对重要特征进行讨论”。《Guideline on strategies to identify and mitigate risks for first-in-human and early clinical trials with investigational medicinal products》（EMEA/CHMP/SWP/28367/07）则规定：“若观察到严重毒性反应或动物死亡，且在已开展的研究中无法明确死亡原因或毒性作用机制，同时该信息对临床试验设计或安全性监测计划具有重要意义，则可能需要开展额外研究以确定死亡原因或毒性作用机制”。这些指南均表明，理解死亡原因（若发生死亡）具有重要意义；而就ICH而言，需尽可能减少死亡这一结果的发生。

尽管已有上述法规，但针对死亡或濒死状态原因调查应包含哪些内容，目前仍缺乏具体指导。因此，本调查旨在探究当前行业实践，包括在毒性研究中运用多种影响因素及开展额外评估以确定COD的做法。

当前实践回顾

2022年12月至2023年3月，研究人员对毒理病理学会（STP）具有全球代表性的会员开展了一项调查。本次调查聚焦非啮齿类动物研究，主要涉及犬类和NHP。

问题分为4个部分，具体如下：

·A部分：关于COD判定与记录的一般性问题

·B部分：全面组织评估研究中采用的方法

·C部分：有限组织评估或无组织评估研究中采用的方法

·D部分：非研究用动物或种群动物的死亡原因

A部分：死亡原因一般性问题

在30名受访者中，仅33%表示其所在机构要求在组织病理学数据采集系统中明确死亡原因。在被要求录入死亡原因的受访者中，约半数仅能记录一个死亡影响因素。

对于表示无需在数据采集系统中明确死亡原因的受访者，均在报告正文中记录死亡原因。几乎所有受访者都会在报告正文中对死亡原因进行评述，即便已在组织病理学数据采集系统中录入相关信息；且具体而言，死亡原因会纳入研究报告的死亡率部分。

根据受访者经验，确定直接或主要死亡原因的成功率存在差异，70%的受访者表示“经常”或“大部分时间”（>45%的情况）能成功确定。

B部分与C部分：全面组织研究、有限组织评估或无组织评估研究

B部分的问题围绕全面组织研究（主要是GLP毒性/安全性研究）展开，询问死亡原因的判定方法。C部分则探究在非GLP、无组织评估或有限组织评估研究中，死亡原因判定方法与全面组织清单研究的差异。

对于所有毒性/安全性研究，超50%的受访者表示，在所有非啮齿类动物研究（GLP或非GLP）的试验方案或标准操作规程（SOP）中，通常会纳入用于辅助判定非计划尸检死亡原因的终点指标，包括全面组织清单、血液学、临床化学、凝血/止血及毒代动力学（TK）采样。纳入频率较低（<50%）的终点指标包括尿液分析、骨髓涂片、抗药物抗体评估、特殊染色、传染病血清检测、细菌学采样及粪便评估。

73%的受访者表示，为辅助判定死亡原因，曾开展试验方案或SOP中未常规规定的额外评估，包括特殊染色、免疫组织化学（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）、微生物学检测及组织质谱分析等多种方法。

大多数受访者遵循试验方案驱动，或同时遵循试验方案与SOP驱动的死亡原因评估流程，并采用预先设定的标准。在GLP安全性研究中，67%的受访者表示非计划尸检与计划尸检的样本采集方式无差异，但会根据研究特定情况或因素调整组织采集或评估方式。对于采用不同样本采集方式的受访者，其试验方案允许采集额外样本（如血清/血浆或组织），以辅助阐明过敏样反应或急性超敏反应等症状。

超半数受访者（57%）表示，对于发现死亡的动物与选择性安乐死（非计划）的动物，死亡原因判定方法存在差异。主要差异在于，对于发现死亡的动物，无法采集或难以采集血液样本、器官重量数据、骨髓涂片及冷冻样本。对于在计划终止前选择性安乐死的动物，72%的受访者表示会同时开展血液学和临床化学评估，而仅44%会进行TK评估，约33%会评估抗药物抗体。部分受访者解释，这些评估需取决于样本可获得性、研究数据或药物类别。

62%的受访者表示，会根据具体情况或申办方要求（包括临床症状或大体观察结果等研究特定情况）调整组织采集方式。但需注意的是，病理学家为解读结果而要求额外采集组织时，通常拥有科学自主权（例如，当处理组动物出现皮肤病变时，病理学家可能会要求采集对照组代表性样本以作比较）。有评论指出，对SOP或试验方案驱动的样本采集方式的调整，需在试验方案修订版中说明。

40%的受访者表示，死亡原因评估方式会因受试物或其他因素（包括适应症、给药方式或给药途径）而不同。这些受访者提及的最常见因素为给药途径、已知风险因素及给药方式。

当非计划安乐死可能与免疫反应相关时，31%的受访者不会开展额外评估。对于表示会开展额外评估的受访者，各项评估活动的分布较为均匀，且多数评估需根据具体情况确定。

79%的受访者表示，不同非啮齿类动物物种的死亡原因判定方法无差异。对于存在差异的受访者，不止一人表示会对非人灵长类动物采集比犬、猪等其他大型动物更多的样本。

在试验方案未规定组织采集，或明确要求终末尸检采用有限组织清单的研究中，与GLP全面组织研究相比，56%的受访者对死亡动物采用不同且更有限的组织样本集；但仍有44%的受访者，即便在有限组织/无组织研究中，也会对死亡动物采集“全面”的组织清单。

在犬、非人灵长类动物、猪开展的非GLP探索性研究或机制性研究中，绝大多数非计划死亡动物会通过组织病理学专门评估死亡原因（至少根据具体情况评估），而兔子的此类评估频率较低。

D部分：非研究用动物

D部分的问题旨在探究是否可能利用同期或近期共饲养、共运输的非研究用动物信息，为研究用动物死亡原因提供参考。该部分涉及的动物包括种群动物及备用动物（研究方案初始设计中纳入的额外动物，以备按方案要求替换动物时使用）。

受访者对种群/储备动物死亡原因的评估方式存在差异：部分受访者采用与研究用动物相同或更严格的评估方式，部分则采用更宽松的评估方式。需注意的是，40%的受访者表示“不确定”或“不适用”，这表明并非所有受访者都直接参与种群动物的管理。更宽松的评估方式基于活体观察、临床病理学及大体病理学评估，并结合针对性采样，通过整体分析而非全面组织评估来判定死亡原因。

约70%对种群/储备动物或非研究用死亡动物开展评估的受访者表示，会将相关数据用于解读研究结果，主要用于分析传染病或种群健康问题。例如，食蟹猴肝炎感染会影响对肝脏炎症灶的解读；另一个例子是家兔黏液性肠炎暴发，这对解释研究结果具有重要意义。部分受访者还表示，过去曾通过了解种群中的背景感染情况，区分背景发现与受试物相关发现。

综上，可以看出，在GLP研究中，大多数受访者对非计划尸检与计划尸检的常规样本采集采用相同方式，且多数表示会在必要时通过修订试验方案开展额外评估，以辅助判定死亡原因（COD）。试验方案中规定的死亡原因判定终点指标包括全面组织清单、血液学、临床化学、凝血/止血及TK采样。即便在试验方案规定有限组织采集的研究中，仍有近半数（44%）的受访者将为死亡动物采集“全面”组织清单作为标准操作。另外，尽管约70%的受访者表示，在超过45%的情况下能成功确定直接或主要死亡原因（通常通过多个终点指标的证据权重判定），但仍存在无法明确死亡原因及其与受试物关联的情况。

结论与考量要点

明确死亡原因对于构建数据体系以支持产品申报至关重要。这是因为，区分与所研究受试物相关的发病和死亡，以及与受试物无关的偶然情况（如与操作相关或与背景/种群地方性疾病相关的情况）具有重要意义。对于非啮齿类动物研究而言，死亡原因判定尤为关键，因为这类研究中接受评估的动物数量本就较少。

监管机构向申办方反馈时始终强调，在一般毒理研究中应尽力明确死亡或濒死状态的原因。理想情况下，非临床研究（尤其是非啮齿类动物研究）的设计应能避免出现严重毒性反应、意外动物死亡，或因受试物反应而需实施安乐死的情况。然而，目前针对死亡或濒死状态原因调查应包含哪些内容，仍缺乏具体指导。

调查数据凸显了在毒性研究中评估死亡原因的重要性。这对于理解受试物毒性影响及潜在致死后果至关重要。区分与受试物相关的死亡和偶然死亡，有助于解读研究结果，尤其是在存在并发传染病或种群健康问题的情况下。此外，评估死亡原因还能通过进一步了解并应对新型给药方式或疗法的有害影响，提升动物福利水平。

本文呈现的数据为非啮齿类动物毒性研究中死亡原因的判定与报告提供了当前实践参考及相关考量。这些发现可为病理学家、毒理学家及监管机构提供指导，助力其准确评估受试物对非啮齿类动物的潜在危害，进而为该受试物在其他毒性研究或临床研究中的进一步探索提供数据支持。

基于对调查结果、法规、文献及工作组经验的综合考量，以下为非临床研究中死亡原因评估提出的考量要点。

考量要点1

对于所有死亡或提前安乐死的非啮齿类动物，应尽可能通过细致调查死亡原因，并采用相关途径与方法，明确主要死亡原因或主要促成死亡原因。

无论动物所属组别（即对照组动物与给药组动物同等重要），均需开展此项判定工作。研究方案中应明确死亡原因判定相关内容，描述在出现濒死状态或死亡时需采用的操作流程及终点指标。

考量要点2

若无法通过标准终点指标或评估明确死亡原因，应根据研究特定情况或因素（如既往经验、基于化合物作用机制预期的效应），开展额外组织采集或其他评估。

例如，抗药抗体及免疫复合物疾病是单克隆抗体研究中常见的关注点。因此，可考虑增加终点指标，如采集肾脏样本进行电子显微镜检查以确认免疫复合物沉积，或采集提前处死动物及同期对照组动物的血液样本以评估补体激活情况。另一个例子是疑似过敏样反应，此时可能需要采集样本以评估超敏反应标志物（如免疫球蛋白E、组胺和/或类胰蛋白酶）。再如传染病研究中，采集诊断性样本可能有助于解读研究数据，同时也有助于了解潜在的种群健康问题。

考量要点3

应在数据采集系统和/或报告正文中明确记录死亡原因，且在可能的情况下，需说明该死亡或发病是否与受试物相关。

若已尽最大努力仍无法判定死亡原因，需在报告正文中明确说明，包括无法判定的原因及与受试物的潜在关联，以便该信息能用于未来研究的风险评估。解剖病理学家与临床病理学家应确保死亡原因判定采用综合方法，且该方法需充分符合诊断病理学原理，包括避免将死亡原因归咎于相对轻微的发现或病变，认为此类发现或病变不太可能真正导致发病或死亡。

考量要点4

对于机构内所有死亡或非计划安乐死的非啮齿类动物，无论其是否为研究用动物或来自动物房，均应尝试判定其死亡原因。兽医人员与研究团队（包括病理学家）之间应保持持续、开放的沟通，以确保高效协作及实时决策。当利用特定动物开展的研究中出现异常变化时，评估与这些潜在研究用动物共饲养或共运输的动物房动物，可能会为解读变化提供参考。

引自：Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider* for Determining and Reporting Cause of Death/Moribundity in Non-Rodent Species in Toxicity Studies