微生物实验室中的无菌操作细则

无菌操作，是指在无菌室或超净台中进行以防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。无菌操作是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。无菌操作的要求是：操作前将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭；操作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入。

今天我们来讲讲微生物实验中的无菌操作。

一、环境无菌

环境有大环境（房间）和小环境（操作台）。

1）、大环境无菌

1、实验室布局设计宜遵循检测对象“单方向工作流程“原则，防止潜在的交叉污染；

2、应有专门微生物检测无菌间，并通过缓冲间与准备间等进行区隔；

3、有单独的通风系统，且实验室内实行负压通风；

4、实验前打开紫外灯进行消毒，定期对环境进行消毒及监测，保证环境条件满足检测要求。

2）、小环境无菌

1、实验前使用75%酒精对工作台内部进行消毒，并提前30分钟打开工作台紫外灯对超净台内部环境进行杀菌；

2、实验时打开风机开关，适当调整风速，但不得过低；

3、实验器材、样品进入工作台前需使用75%酒精进行喷洒消毒；

4、做样时在酒精灯的外焰保护区进行操作，实验时需远离工作台边沿15公分以上；

注意事项：①紫外灯的寿命有限制，长时间使用后紫外灯消毒效果下降，需要定期进行发光频率测量，及时进行更换；②无菌室需要定期进行环境监测，测试环境是否符合检测要求，如不符合，要停止实验并采取措施，检测合格后才能进行实验，监测记录需保存。

二、无菌采样

1、包装完好的样品采集最小包装；

2、散装样品采用无菌采样，具体要求如下：

1）采样者需在操作前佩戴一次性专用无菌防护手套，在正常穿戴时不能直接接触污染无菌手套和随意触碰样品表面；

2）首次取样前，要先用75%的专用酒精对一次性无菌消毒手套外部材料进行消毒。待无菌手套的表面经过短暂干燥后，方可开始取样；

3）撕开无菌袋的封口处，捏住两侧小心打开无菌袋口。

4）采集无菌样品，现场的灭菌工作人员配备了灭菌工具，用现场的灭菌设备进行无菌采样,若没有设备，用自备的无菌取样工具进行无菌取样。

5）采样准备工作进行完毕，无菌袋内部进行严密封口，保证采样样品不会漏出来，不被外界所污染。

6）冷藏、冷冻等样品要进行低温保存。

三、实验耗材

1、培养基、试剂：按照培养基要求进行灭菌（煮沸灭菌、湿热灭菌）。

2、剪刀、勺子等金属：牛皮纸包扎后进行灭菌，专样专用，不得连续做样；使用后以灼烧方式灭菌；

3、枪头、玻璃器皿：采用湿热灭菌方式进行灭菌；

4、取样袋：可先用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒；

5、电子称表面用75%酒精消毒；

6、接种针/环：以灼烧方式灭菌，一次性物品选择独立包装，以75%酒精消毒外包装，再使用紫外灯消毒；

四、人员操作

1、实验前缓冲间换衣、消毒，佩戴手套鞋套、帽子，实验中不得随意进出，每次进出均需重新换衣消毒；

2、实验物资、样品均需通过实验室的传递窗进行传递，不得携带物品从人员进出口进出；

3、传递窗需区分脏净区，不得混用，如只有一个传递窗，使用前后均需灭菌；

4、实验物资耗材均需进行消毒，且不得与样品一同放置统一传递窗；

5、进入超净台的物资均需使用75%酒精消毒，人员需消毒至腕部以上进工作台的区域；

6、往瓶中加样品时，需注意勺子或袋子等尽量不要接触瓶口；

7、缓冲液温度以40℃左右为宜，不能过热，避免部分微生物烫死；

8、样品计量要准确，进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性；

9、倾倒平皿时，培养基瓶口不要接触到平皿，摇匀时要轻，不要将培养基溅到盖子上与皿壁相连；

10、倾倒的培养基要适量，以 15mL 左右为宜，培养基过少会导致平板在培养过程中干掉，微生物亦死亡；

11、接种时，接种针/环灼烧后要进行冷却，避免菌落死亡；

12、工作台面上也需要区分脏净区，实验完毕的样品、物资单独放置，避免交叉污染；

13、致病菌实验时应有前后顺序，一项致病菌实验后对台面进行消毒再进行另一项实验；

14、实验结束后，及时将培养基放入培养箱进行培养，并对实验台面进行清洁消毒。

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