免疫组化实验操作全流程避坑要点

免疫组化实验流程环环相扣，任何一步的疏忽都可能导致前功尽弃。本文将按照典型操作流程，串联关键步骤，并集成常见“坑点”与解决方案，形成一份实用的操作指南。

第一步：样本制备与切片处理。

这是实验的起点，至关重要。

① 脱蜡与水化：石蜡切片必须彻底脱蜡。建议将切片在60℃烘烤20分钟后，立即放入新鲜的二甲苯中操作，并确保后续梯度乙醇（如100%、95%、80%）也是新鲜配制的，以保证充分水化，否则会影响抗体渗透。

② 抗原修复：根据目标抗原特性，选择热修复（柠檬酸缓冲液、EDTA等）或酶修复（蛋白酶K、胰蛋白酶等），并优化修复时间和强度。过度修复可能破坏抗原，修复不足则导致信号弱。

第二步：阻断与封闭。

① 内源性酶阻断：对于HRP系统，常用3% H₂O₂处理以消除内源性过氧化物酶活性；对于AP系统，则使用左旋咪唑。

② 非特异性位点封闭：使用与二抗同源的非免疫血清（如5%山羊血清）或BSA进行封闭，时间通常为30-60分钟，可有效降低背景。

第三步：抗体孵育。

① 一抗孵育：使用优化后的工作浓度，4℃过夜孵育效果通常优于室温短时孵育。孵育时确保切片水平，并保持湿润。

② 洗涤：孵育后需用PBS或TBST充分洗涤，以去除未结合及非特异性结合的抗体。建议采用三次，每次5分钟的洗涤方式。

③ 二抗孵育：根据一抗种属选择对应的酶标或荧光标记二抗，室温避光孵育30-60分钟。同样需要充分洗涤。

第四步：显色与复染。

① 显色：对于DAB显色，需新鲜配制底物工作液，并在显微镜下控制显色时间，及时终止反应（浸入蒸馏水或PBS），防止背景过深或过显。

② 复染：常用苏木精对细胞核进行复染，提供组织形态学对照。复染后需再次蓝化（返蓝）。

第五步：封片与观察。 脱水透明后，用中性树胶封片。对于荧光样品，需使用抗淬灭封片剂，并尽快观察。

贯穿始终的注意事项：

① 设置对照：每批实验必须同步运行阳性对照和阴性对照（如用PBS代替一抗）。

② 防止干片：从脱蜡到封片前，任何时候都不应让切片完全干燥。③ 试剂分装与标记：不同抗体、不同批次的试剂应清晰标记，避免混淆。

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