湖北
Calcein-AM（绿）与碘化丙啶（PI，红）的荧光双染组合，是直观评估细胞群体存活率的经典方法。然而，绿色与红色荧光的解读远非“绿活红死”那么简单。不当的染色条件会导致假阳性或假阴性信号，错误估计细胞状态。
Calcein-AM本身不发荧光，它依靠活细胞内的酯酶将其水解为带负电的绿色荧光物质Calcein，从而被滞留在胞内。假阴性风险在于：某些细胞类型（如原代细胞、静息期细胞或代谢受抑制的细胞）的酯酶活性可能较低，水解效率不足，导致绿色荧光信号弱。此时并非细胞死亡，而是标记效率低下。反之，若染色浓度过高或孵育时间过长，Calcein可能从健康细胞中泄漏出来，或被死细胞非特异性吸附，造成背景升高和假阳性信号。
PI的机制是嵌入双链核酸（DNA/RNA），但其进入细胞的先决条件是膜完整性丧失。PI的假阳性常源于染色条件过于剧烈。过高的PI浓度（通常>5 μg/mL）或过长的孵育时间，可能使膜电位发生轻微变化但并未死亡的细胞也被染色。此外，细胞在处理过程中遭受的机械损伤（如吹打过猛）或消化不当，会产生大量膜破损的“技术性死亡”细胞，干扰对真实生物学死亡的判断。
染色缓冲液的选择影响重大。使用不含钙、镁离子的PBS缓冲液进行洗涤和染色，可能削弱细胞膜稳定性，加剧染料渗漏。推荐使用含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液。对于追求结果稳定性和操作简便性的实验者，选用商品化的活死细胞双染试剂盒是一个可靠的选择。
这类试剂盒，例如Abbkine提供的活细胞与死细胞双色检测试剂盒，通常会提供经过优化配比的染料组合及专用的染色缓冲液，旨在简化流程，同时确保对活细胞和死细胞的特异性标记，减少因自配染料浓度不准或缓冲液不当带来的偏差。
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