细胞凋亡全景图：Annexin V/ PI, Caspase, TUNEL 该如何选择？

细胞凋亡，这场程序性的“细胞自杀”，井然有序且沉默无声。如何捕捉其不同阶段的证据，决定了我们理解的深度。

在药物筛选中，您需要快速评估化合物是否诱导肿瘤细胞凋亡；在神经退行性疾病研究中，您要精确定位脑切片中濒死的神经元；在干细胞治疗产品放行时，法规要求您准确量化凋亡细胞比例。

面对 Annexin V/PI、Caspase 检测、TUNEL 等多种方法，选择并非随意。每种方法都是一扇窗，望向凋亡过程的不同阶段。选错窗口，您可能错过关键景象，甚至产生误解。

01 引言：细胞凋亡——一场编排精密的“多幕剧”

细胞凋亡不是随机坏死，而是一套基因编码的、高度保守的程序性死亡过程。其核心阶段可简化为：

1. 早期：接收到死亡信号，线粒体外膜通透性改变，磷脂酰丝氨酸（PS）由细胞膜内叶翻转到外叶。
2. 中期Caspase 蛋白酶家族被激活，执行“切割”任务，分解关键细胞蛋白。
3. 晚期DNA 断裂成寡核小体片段，细胞裂解为凋亡小体，被周围细胞吞噬。

不同的检测方法，正是捕捉这些不同阶段的“探针”。

02 早期预警：膜磷脂外翻——Annexin V/PI 法

原理：Annexin V 是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对翻转到膜外的PS具有高亲和力。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，不能透过完整细胞膜，但可进入膜破损的细胞。

如何操作与解读？

细胞悬液与 Annexin V 荧光标记物（如 FITC）和 PI 共孵育后，通过流式细胞术或荧光显微镜分析。

• 左下象限（Annexin V-/PI-）：活细胞。
• 右下象限（Annexin V+/PI-）早期凋亡细胞（PS外露，膜完整）。
• 右上象限（Annexin V+/PI+）晚期凋亡或坏死细胞（PS外露，膜破损）。
• 左上象限（Annexin V-/PI+）：通常很少，可能是机械损伤细胞或晚期坏死细胞。

优点与局限性

• 优点：快速、简便、可定量，是流式分析凋亡的“金标准”起始方法。
• 致命局限无法区分晚期凋亡与原发性坏死。两者都表现为Annexin V和PI双阳性。此外，消化、离心等操作可能导致PS假阳性，需设置未经诱导的平行样本作为基准。

03 核心执行者：Caspase 活化检测

如果说凋亡是拆除大楼，Caspase 就是挥舞剪刀的“拆除工人”。检测它们的活性，是确认凋亡程序已进入不可逆执行阶段的关键。

方法一：活性Caspase检测

使用细胞渗透性荧光标记底物。例如，FITC-DEVD-FMK，其中DEVD是Caspase-3/7的识别序列，FMK基团可与活化的Caspase不可逆结合。细胞孵育后洗涤，即可上机检测。

• 优点无需固定破膜，可进行活细胞实时或终点检测；信号与活性直接相关，灵敏度高。
• 产品关联：我们的Caspase 活性检测试剂盒采用此原理，优化了底物渗透性与荧光亮度，检测限低至1%的凋亡细胞，且背景信号极低，特别适合高通量筛选或稀有细胞分析。

方法二：活化片段检测（如Cleaved Caspase-3）

通过针对Caspase剪切后新表位的抗体，用WB、流式（需固定破膜）或免疫组化检测。

• 优点：特异性极高，是凋亡的“铁证”；尤其适合石蜡包埋组织切片的回顾性研究。
• 时间窗：通常出现在PS外翻之后，DNA断裂之前。

04 不可逆终点：DNA断裂——TUNEL 法

原理：TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）技术，利用酶在DNA断裂产生的3'-OH末端添加荧光标记的dUTP。

为什么它是“黄金标准”？

• 高度特异性：直接标记凋亡最特征性的晚期事件——DNA断裂。
• 定位精准：尤其适用于组织切片，可在复杂组织结构中精确定位单个凋亡细胞。
• 形态学关联：结合DAPI等核染，可观察到典型的凋亡核形态（核固缩、碎裂）。

重要注意事项

• 不能区分凋亡与坏死：严重坏死也会导致DNA断裂。必须结合细胞/组织形态学判断（凋亡细胞保持膜完整性直至被吞噬，而坏死细胞肿胀、破裂）。
• 步骤繁琐：涉及多个孵育和洗涤步骤，优化不当易导致背景高或信号弱。
• 固定敏感：过度交联的固定剂（如多聚甲醛时间过长）可能掩盖DNA末端，影响标记效率。

05 方案选择决策树与多方法联用策略

面对具体研究问题，如何选择？请遵循以下决策逻辑图：

高阶策略：多方法联用，获取多维证据

1. 流式多色分析Annexin V-FITC + Caspase活性染料（647nm）。这能更精细地区分：Caspase+/Annexin V-（极早期？）、双阳性（执行期）、Annexin V+/Caspase-（Caspase非依赖凋亡？）。
2. 成像多标TUNEL（红） + Cleaved Caspase-3 抗体（绿） + 神经元标记（远红）。用于脑切片研究，可明确证明“某个特定类型的神经元正在发生 Caspase 依赖的凋亡”。

对照设置（必不可少！）

• 阴性对照：正常培养、未经任何诱导的细胞/组织。
• 阳性对照：用标准凋亡诱导剂（如星形孢菌素STS用于细胞，地塞米松用于胸腺）处理样本。
• 方法特异性对照：TUNEL实验需设DNA酶I预处理的阳性对照（所有细胞均应阳性），以及不加末端转移酶的阴性对照。

06 总结：没有唯一金标准，只有最适配方案

细胞凋亡检测的本质，是用一把或多把尺子，去度量一个动态过程的不同维度

• Annexin V/PI是快速灵敏的早期警报器，但无法判断死亡方式。
• Caspase检测是确认程序已启动的分子开关，连接着上游信号与下游效应。
• TUNEL是宣告死亡已不可逆的终点裁决，尤其擅长空间定位。

在基础研究中，联合使用2种及以上方法能相互印证，提高结论可靠性。在药物研发的QC环节，应选择与药效最相关且稳定可重复的方法（通常是Annexin V/PI流式法），并写入标准操作程序。

理解每种方法的原理与边界，就是掌握了揭示细胞生死决策的密码，让数据自己讲述清晰而准确的故事。

后记：在最新版的《中国药典》细胞治疗产品总论中，对最终制剂的细胞活率与凋亡比例提出了明确的检测要求与限度。其中明确指出，应采用Annexin V/PI 双染法作为检测细胞凋亡的推荐方法，并需进行充分的方法学验证。这从法规层面确立了该技术在产业中的核心地位，也提醒我们，从基础研究到临床应用，可靠、标准化的检测方法是科学与转化的共同基石。