CAR-T细胞病毒载体生产与质控解析

CAR-T细胞的大规模生产工艺在过去十余年间基本保持稳定。其核心流程是从患者外周血单核细胞（通过白细胞分离术获取）中分离出T细胞，随后在体外利用携带CAR基因的逆转录病毒或慢病毒载体对T细胞进行改造，再经过体外扩增获得足量细胞。在药品生产层面，病毒载体被视为基因治疗产品的起始物料。因此，必须对其生产过程和质量进行严格管控，以确保临床试验的安全与有效。

◈ 一 ◈

CAR-T制造中常用的病毒载体

γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体是目前自体CAR-T细胞制备中最常用的两种病毒载体。两者均属于逆转录病毒科、具有包膜的RNA病毒，在生物学特性上有很多相似之处。但在实际选用时，仍需关注它们在生产和基因组整合方面的关键差异（见表1）。

表1 逆转录病毒载体与慢病毒载体的主要特点

两种载体均能实现较高的转导效率和长期稳定的转基因表达。转导过程中，病毒RNA基因组经逆转录后，以半随机方式整合入宿主细胞基因组。尽管新一代载体采用“自失活”长末端重复序列（LTR）已显著降低了插入突变风险，但该风险依然存在，且与载体设计密切相。

RV与LVV的生产方式类似：通常采用质粒瞬时转染HEK293T或其衍生细胞（贴壁或悬浮培养），通过一组质粒（包括辅助质粒、包膜蛋白质粒和CAR表达质粒）共同产生仅能感染一轮、无复制能力、无致病性的重组病毒颗粒。虽然理论上可构建稳定包装细胞系，但LVV的稳转系构建难度高于RV。生产过程中，细胞向培养基中释放大量直径约100 nm、结构相对脆弱的包膜病毒颗粒，随后需经过快速的下游处理步骤进行浓缩、纯化与冷冻。一般而言，LVV比RV更能耐受下游工艺的严苛条件。

◈ 二 ◈

病毒载体的GMP生产

用于临床试验的病毒载体需在符合GMP规范下进行规模化生产（通常收获培养液体积不低于50升）。目前主流方式仍是通过质粒瞬时转染HEK293T系细胞生产，转染后48-72小时收获病毒液。

贴壁培养系统（如多层细胞工厂）已有十多年应用历史，而新型固定床生物反应器则能提供更大表面积（可达500–600 m²，相当于1000升培养体积），且占地面积小，更适合一次性使用，易于符合GMP要求。悬浮培养则多采用搅拌罐生物反应器；为降低剪切力对病毒载体的影响，波浪式生物反应器 WAVE 更温和方式也在不断探索中。

采用稳定生产细胞系可简化流程、降低资源消耗，从而缓解大规模生产的瓶颈。稳定系更易于实施灌流或再循环等工艺强化策略，实现高密度培养并获得更高病毒滴度。但其缺点是对产品变更的灵活性不如瞬时转染系统。

无论上游工艺如何，病毒颗粒均需从收获的细胞培养液中回收，并经过下游纯化与浓缩步骤，一般包括（顺序可调整）：深层过滤、核酸酶处理、切向流过滤/透析、离子交换色谱及无菌过滤。下游工艺的稳健性很大程度上取决于载体包膜的选择。VSV-G包膜因其耐受性强（可承受切向流过滤和色谱操作中的剪切力与盐度变化），已成为工业化生产的首选。整个过程需在保持病毒活性与最大限度去除杂质之间取得平衡。纯化后的载体需配制于适宜的保护剂中，于-70°C以下长期保存，且不影响后续对T细胞的转导能力。

典型病毒载体生产工艺流程示意图

◈ 三 ◈

病毒载体批次的质量控制

病毒载体作为CAR-T细胞的起始物料，必须在GMP或类似GMP条件下生产。其批次放行检测主要包括以下六大类指标：理化性质、数量、鉴别、安全性、纯度和效力，具体检测项目及方法见表2。

表2 病毒载体批次典型放行检测项目

效力检测在产品进入临床后期及申报上市时尤为重要。此类检测应定量化，并尽可能反映产品的作用机制，通常包括病毒感染性、转基因RNA/蛋白表达水平及功能学实验等多维度评估。

工艺相关杂质（如BSA、残留质粒）的检测需根据生产过程中是否使用相应试剂来决定。部分纯度项目在理由充分的情况下，可不纳入批放行检测，仅作为产品表征研究。关键杂质（如宿主DNA、宿主蛋白）的接受限度应由申办方基于风险评估来确定。

此外，建议对病毒载体进行进一步表征分析，例如病毒颗粒的“完整/空壳”比例分析或基因组整合位点谱分析。

总结与展望

目前，基于逆转录病毒或慢病毒载体的体外CAR-T细胞生产技术已支撑了多项临床试验和上市产品。展望未来，随着新型载体在临床前研究中展现出潜力，体内直接改造患者 T 细胞已经成为更具吸引力的方向，从而规避体外制备带来的诸多物流与成本挑战。当然，用于体内的载体将作为最终的基因治疗产品，对其安全性与效能的要求也将更为严苛。

参考文献

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