【合成经验】反相Flash柱层析可以干法上样吗？

是有机合成中最常用的分离纯化手段，大公司合成实验室一般都配备自动化程度比较高的分离纯化工具---快速制备色谱仪(中低压制备色谱)，在医药外包公司俗称过柱机。由名字可知，这就是个替代手工过柱的工具，他所用到的柱子我们常叫它Flash柱。除了可以用来过硅胶正相柱，还可以过乙腈(甲醇）/水体系的C18填料的反相柱，反相柱一定程度上可以替代制备高效液相色谱，特别是大量样品分离时，可以节省大量成本。

往期文章: 【】中已经详细介绍了湿法上样和干法上样，文章中主要是介绍了硅胶柱柱层析技术，因此用过柱机过正相硅胶柱时情况类似。

反相柱层析最常用的填料是C18反相硅胶填料，这类反相硅胶是利用C18烷基硅烷将硅胶的-SiOH基团封住，形成了很多C18键合微孔，对于小极性的化合物吸附能强，相反对大极性的化合物的吸附能力弱，因此和正相硅胶的洗脱顺序相反，因此称为反相硅胶。

我们在进行反相柱层析时，梯度洗脱开始以大比例极性水溶液开始，由于C18反相硅胶填料表面疏水性，疏水官能团就会发生蜷缩，因此使用前需要用极性有机溶剂活化（疏水官能团得以舒展），再过渡到水溶剂（保持其吸附活性）。活化平衡的步骤必不可少，否则会明显影响分离效率。

对于 乙腈(甲醇）/水体系的C18填料的反相柱 ，湿法上样是应用最广泛，使用最简单的上样技术。如果是固体样品，只需将样品直接溶解在尽量少的溶剂中，然后注入色谱柱中即可完成上样，而如果是液体样品，其上样方式则会更简单，直接将样品注入色谱柱即可。但是湿法上样有一些缺点：1、当上样体积增大时，样品在色谱柱当中所占用的体积会增大，扩散效应也会明显增强，导致色带变宽，降低分离效率，纯度也随之降低；2、请尽量使用大极性的溶剂溶解样品，如果极性过小，样品还没有来得及和固定相相互作用，就已经被极性溶剂洗脱下色谱柱，导致保留时间不够，洗脱不充分，分离效率大大降低。特别是极性特别大的样品，湿法上样后很容易直接把样品冲出，没有分离效果。

C18反相柱能否像正相硅胶柱一样，拌样后，进行干法上样呢？

小编亲试，完全可以进行干法上样，唯一的缺点就是C18填料有点贵，但是拌样后的C18填料可以冲洗干净后可以重复利用。与硅胶柱的拌样类似，先用沸点较低溶剂溶解样品，加入C18硅胶后，旋干，然后将干粉转移到空柱子中，填料上方加上筛板或脱脂棉都可以，旋紧，将上样柱接在反相柱上直接过柱就可以了（建议先将反相柱平衡好，接上上样柱后直接运行梯度）。

反相柱干法上样相比湿法有以下优点：一、干法上样峰型变窄，分离效果明显提高。二、另外对于一些溶解度较差的样品，如果利用湿法上样，需要用大量的溶剂溶解，因此上样量受到限制，如果一次上太多，分离效果很差，但干法上样克服了此缺点。三、还有一些样品湿法上样注入反相柱后，直接从水相比例较高的梯度开始冲柱时，产品会迅速析出，导致柱子堵住，干法上样则很少堵柱。四、对于大极性的化合物（LCMS保留时间在0.5min以内的化合物），湿法上样，有时直接用水相就可以将化合物冲出，用干法上样则可以明显提高柱效以及分离样品纯度。五、上文中提到C18反相硅胶中有很多C18链硅氧键，因此强酸体系不能直接拌样，否则硅氧键断裂，C18硅胶失效，会明显影响分离效果。