荧光相关光谱 (FCS)

　　图 1： FCS 成像系统。光聚焦在一定的体积内，当荧光团移入激光检测体积时可以观察到分子动力学。改编自 DKFZ_FCS。

　　介绍

　　荧光相关光谱 (FCS) 可测量由于对目标荧光团的任何物理、化学或生物效应而产生的荧光强度波动。原则上，光聚焦在样品的某个区域，并测量该区域的荧光强度的波动。荧光强度的这种波动可能是由各种动力学引起的，包括粒子的布朗运动。布朗运动是液体/气体中的分子由于与环境中其他快速移动的粒子碰撞而发生的随机运动的术语。这会导致粒子(在本例中为荧光粒子或荧光团)位置的随机波动。

　　对某个区域的 FCS 分析返回该区域中荧光团的平均数量以及它们穿过该区域时的平均扩散时间。可以进一步分析该数据以了解荧光团大小、荧光团浓度、溶液粘度和扩散系数。 FCS 是一种极其灵敏的分析工具，因为它能够测量小体积内极少量的分子(纳/皮摩尔浓度)。

　　FCS成像系统

　　典型的 FCS 成像系统由激光作为激发源。激光聚焦在样品的特定区域，穿过激光焦点体积的荧光分子被激发并发出荧光。发射的荧光通过物镜返回并被灵敏的科学相机检测到，如图 1所示。收到的数据通常是随时间变化的荧光强度，但可以通过相关分析进行进一步分析。

　　相关性

　　为了查看两个变量是否相互相关，我们可以查看相关性。两个变量之间的关系可以用统计方式表示，称为相关系数(或皮尔逊相关)。相关系数值的范围可以在 -1 和 +1 之间(记为r)，分别是完美的负/正相关，0 表示两个变量之间没有相关性和没有关系。一些示例相关性如图 2所示。

　　图 2：相关系数表示两组数据如何相互关联。 A 和 D 显示完美否定 (A)或正相关 (D)，这在正常实验中不太可能出现。 B 和 E 显示出很强的负相关 (B) 或正相关 (E)。C几乎没有相关性，数据点聚集在一处，没有明确的关系，r值接近于0。F 显示完全不相关(r = 0)，两个变量之间的关系不是线性的。改编自简介saylordotorg 的统计数据。

　　荧光自相关

　　自相关或序列相关是信号与其自身的延迟副本之间的相关性。换句话说，它是连续时间点上同一变量的两个值之间的相关性。与标准相关性不同，自相关性只涉及一个变量与其自身进行比较，而不是两个变量之间进行比较。这允许自相关来表示原始值和稍后时间的值之间的相似程度。

　　在FCS中，荧光自相关测量不同时间点的荧光强度，如图3所示。这种自相关函数(ACF)是研究分子时的一个重要变量，因为荧光团扩散系数(激光观察体积内分子的平均跃迁时间)与ACF 宽度成反比，荧光团浓度与ACF振幅成反比。

　　图 3： FCS 中的荧光自相关。左图显示了荧光强度随时间的波动，时间点 (t) 和稍后时间点 (t+τ) 之间可能存在自相关。右图显示了时间点 (t) 和稍后时间点 (t+τ) 之间的自相关函数 (ACF)。

　　使用 FCS 测量的常见标准之一是荧光分子进出观察体积的扩散速率。一旦荧光分子进入该区域，就可以观察到荧光强度的波动。通过将荧光波动转换为ACF，可以提取扩散系数和浓度，如图4所示。

　　图 4： FCS 可用于比较活细胞中不同分子之间的扩散速率和浓度。改编自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

　　FCCS 和 FLCS

　　FCS 有许多子技术，包括荧光互相关光谱 (FCCS)和荧光寿命相关光谱 (FLCS)。

　　FCCS

　　荧光互相关光谱 (FCCS)关联来自两个不同荧光团的信号，在两个单独的通道(例如绿色和红色荧光)中检测到。当光谱不同的荧光团附着到两个分子上时，可以进行双色 FCCS，显示两种类型荧光团之间的相互作用。这对于研究低分子浓度下的结合动力学特别有用。本质上，FCCS可用于以动态方式研究分子结合伴侣以及两个标记蛋白的共定位，如图5所示。

　　为了研究两个标记分子 A(绿色)和 B(红色)是否是结合伙伴，可以分析每个分子的 ACF。如果分子 A (ACFg) 和 B (ACFr) 随时间的荧光强度遵循相同的模式并且它们相关，则这将导致高振幅互相关函数( CCF )(图 5上图)。另一方面，如果两个分子彼此独立地围绕定义的体积移动，则这些分子的 不会相关，从而导致低振幅CCF(图 5下图)。此外，如果只有一个粒子群具有两个标签(绿色和红色)，则 CCF 的振幅将位于两个示例情况之间，如图 5所示.

　　图 5： FCCS 是寻找细胞中结合伴侣的有用方法。改编自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

　　FLCS

　　荧光寿命相关光谱 (FLCS)使用脉冲激光，而不是 FCS 和 FCCS 中的连续激光。这允许进行更复杂的分析，FLCS 消除了荧光团之间的背景或光谱串扰。当荧光团无法分离或多个荧光团的荧光寿命不同时，这非常有用。 FCS、FCCS和FLCS之间的相关幅度比较如图6所示。

　　图 6： FCS(黑色)、FCCS(红色)和 FLCS(蓝色/绿色)随时间变化的相关幅度。消除光散射的效果可以在绿色和蓝色迹线之间看到，显示相关幅度在技术之间的差异。

　　燃料电池系统应用

　　FCS 可以与多种显微镜技术结合使用，例如共焦、双光子、受激发射损耗显微镜 ( STED ) 和全内反射荧光 ( TIRF )。这些技术涉及将光聚焦在样品上，并通过使用 FCS 测量荧光强度波动，可以获得有关荧光团扩散、荧光团浓度和反应速率的附加定量信息。

　　例如，FCS已被广泛用于阐明细胞膜中脂质和蛋白质的组织。这种组织水平对于细胞至关重要，因为它们在细胞过程(例如内吞和信号传导途径)中发挥着重要作用。通过比较几种蛋白质的扩散，已经表明一些蛋白质对某些域具有更高的选择性。另一方面，胆固醇消耗后扩散系数的增加代表相关蛋白质对富含胆固醇的结构域的亲和力。 FCS 是研究活细胞分子动力学的强大工具，提供有关细胞内和细胞区室中的分子和扩散的定量答案。

　　相机

　　由于 FCS 是一种观察少量分子的技术，因此相机的视场 (FOV) 并不是重要因素，而 FCS 探测器需要关注速度和灵敏度。 FCS 相机需要高量子效率和优化的像素尺寸，以及高达每秒 1000 帧的速度，才能检测快速动态结合事件。新的 sCMOS 相机技术可实现单分子事件的高灵敏度和高速成像，使其适用于 FCS。

　　总结

　　在 FCS 中，激发光聚焦在定义的体积上，一旦荧光分子通过该体积，荧光强度就会发生波动。因此，可以获得 ACF 曲线并获得重要信息，例如分子在质膜中扩散的速度、溶液中某些分子的浓度以及在活细胞中定位结合伴侣。

　　大约 50 年前，当 FCS 首次引入显微镜领域时，由于信噪比较低的缺点，它并没有引起太多关注。然而，最近在将多种显微镜方法与相机开发相结合后，FCS 克服了这一缺点，并转变为生物化学和生物物理学等多个研究领域的敏感技术。高帧速率和高灵敏度相机(提供更高的信噪比)可以极大地提高 FCS 方法的效率。因此，背照式 sCMOS 相机将有助于以极短的曝光时间进行成像，从而提高采集速度，这对于高速捕获分子至关重要。极低的噪音性能在这里也很重要。