寡核苷酸检测批间重现性差？哪家品牌色谱柱耐高 pH 且性能稳定

寡核苷酸是由2-30个核苷酸残基通过磷酸二酯键连接而成的短链核酸片段，广泛用于生物治疗（包括基因治疗、RNA干扰和反义寡核苷酸疗法）而备受关注。这些化合物的治疗效果高度依赖其纯度和结构完整性，因此建立稳健的分析方法对质量控制至关重要。

HPLC法是监控寡核苷酸合成的关键技术，能为其纯度和结构完整性提供有价值的参考。然而，由于寡核苷酸结构复杂且存在杂质，传统的HPLC方法在分离寡核苷酸时面临挑战。提高 pH 和温度的条件会进一步增加分离难度，因为传统全孔颗粒（FPP）色谱柱的硅胶填料通常不适合此类条件。

BIOshell™ A120 Oligo C18色谱柱采用熔融核Fused-Core®颗粒技术，具有快速、高效的特点。表面改性的有机硅烷，具有耐碱性，在使用高pH值分离寡核苷酸时具有优异的稳定性，这项创新技术有助于开发稳健的方法，改善碱性化合物的分离效果。碱性化合物在低 pH 条件下通常峰形不佳、保留不足等问题。BIOshell™色谱柱表面惰性的硬件，很好的解决了样品吸附问题，可用于生物惰性系统。

BIOshell™ Å120 Oligo C18色谱柱特点

•120 Å孔径：能分离长达60个碱基的寡核苷酸

•高pH值和高温条件下出色的稳定性：专为分离寡核苷酸而设计

•兼容性：与UHPLC和质谱兼容的键合相

•硬件经表面惰性处理：最大程度降低样品吸附

• 键合相：表面修饰的二甲基十八烷基硅烷
• 颗粒大小: 2.7 μm
• 孔径: 120Å
• USP分类: L1
• 碳载量: 5.6%
• 表面积: 75m2/g
• 是否封端: 是
• 柱温（低pH）: 2/90 °C，柱温（高pH）: 9/85 °C

优异的批间重现性

使用4个不同批次的色谱柱，对含10-60个不同长度碱基的单链DNA样品进行分析。

出峰顺序：1. 10 mer， 2. 15 mer ，3. 20 mer ，4. 25 mer ，5. 30 mer ，6. 40 mer ，7. 50 mer ，8. 60 mer

色谱条件：

色谱柱： BIOshell™ A120 Oligo C18, 2.7μm, 5 cm x 2.1 mm I.D.( 70003-U)

流动相A：10mM TEAA, pH 8.5

流动相B：乙腈

梯度时间：

流速：0.5 mL/min

背压：125 bar

柱温：60 °C

进样体积：1.0 μL

样品溶剂：10mM Tris HCl/1mM EDTA

检测波长：UV/PDA, 254 nm

流通池：1 μL

采集频率100 Hz

响应时间0.025 s

对比实验

与FPP柱相比，BIOshell™ A120 Oligo C18柱在分离寡核苷酸方面表现出更优异的性能。如下图，在高pH条件下，BIOshell™ A120 Oligo C18和其他品牌的寡核苷酸色谱柱分离不同长度的寡核苷酸混合物。在对比色谱柱上，由于FPP色谱柱扩散路径增加，FPP峰形较差，20个碱基及以上的低聚物出现拖尾。由于BIOshell™ Fused-Core®颗粒色谱柱的快速和高柱效，相同样品在BIOshell™色谱柱上无拖尾。

出峰顺序：1.10 mer ，2. 15 mer， 3, 20 mer， 4. 25 mer ，5. 30 mer， 6. 40 mer ，7. 50 mer， 8. 60 mer

色谱条件：

色谱柱： BIOshell™ A120 Oligo C18, 2.7μm, 5 cm x 2.1 mm I.D.( 70003-U)

对比柱：Oligo 130A C18,1.7um,2.1*50mm

流动相A：100mM TEAA, pH 8.5

流动相B：乙腈

梯度时间：

流速：0.5 mL/min

背压：BIOshell™140 bar, 对比柱255bar

柱温：60 °C

进样体积：1.0 μL

样品溶剂：10mM Tris HCl/1mM EDTA

检测波长：UV/PDA, 254 nm

流通池：1 μL

采集频率100 Hz

响应时间0.025 s

分离寡核苷酸混合物

在高pH条件下使用BIOshell™ A120 Oligo C18色谱柱，可以在5分钟内分离出含有6种不同寡核苷酸的样品。

出峰顺序：1.20 mer， 2. 15 mer ，3.12 mer ，4. 25 mer， 5. 33 mer， 6. 12 mer

色谱条件：

色谱柱：BIOshell™ A120 Oligo C18, 2.7μm, 5 cm x 2.1 mm I.D.（70003-U）

流动相A：100mM TEAA, pH 8.5

流动相B：乙腈

梯度时间：

流速：0.4 mL/min

背压：142 bar

柱温：50 °C

进样体积：1 μL of Oligonucleotide Performance Standard Mix, 12-33 NT

样品溶剂：10mM Tris HCl/1mM EDTA

检测波长：PDA, 254 nm

流通池：1 μL

采集频率：100 Hz

相应时间：0.05 sec.

分离不同大小寡核苷酸

以下是分离寡核苷酸标准混合物(含有10-60个ssDNA)的应用。使用了乙酸三乙胺(TEAA)和乙腈梯度洗脱。在3.5分钟内，使用BIOshell™ A120 Oligo C18, 2.7μm, 5 cm x 2.1 mm I.D.( 70003-U)，可分离长达60个碱基的寡核苷酸，并获得优异的峰型和分离。

出峰顺序：1.10 mer ，2. 15 mer， 3, 20 mer， 4. 25 mer ，5. 30 mer ，6 .40 mer ，7 .50 mer ，8. 60 mer

色谱条件：

色谱柱：BIOshell™ A120 Oligo C18, 2.7μm, 5 cm x 2.1 mm I.D.( 70003-U)

流动相A：10mM TEAA, pH 8.5

流动相B：乙腈

梯度时间：

流速：0.5 mL/min

背压：137 bar

柱温：60 °C

进样体积：2.0 μL, (10 μg )

样品溶剂：10mM Tris HCl/1mM EDTA pH=8.0

检测波长：PDA, 254 nm

流通池：1 μL

采集频率：100 Hz

相应时间：0.025 sec.

默克可提供定制cGMP寡核苷酸

如果您计划进行分子诊断(MDx)商业化，实验室研发试验(LDT)，或进行临床前研究，最终的成品试剂盒、检测试剂或药品必须具有非凡的质量水平，符合严苛的监管或研究标准。对于寡核苷酸原料，定制cGMP寡核苷酸是唯一值得您考虑的选择。

根据cGMP生产寡核苷酸可最大限度降低污染、混淆、偏差、失效等错误的概率来规避风险，从而确保寡核苷酸产品满足MDx、LDT和临床前研究的严苛要求。

1. 质量保证—默克寡核苷酸符合最严格的监管标准

• 制造符合美国GMP(21 CFR 820)

• 在分类洁净室内填充ISO 14644-1:2015 Class 8

• 生产厂房符合ISO 13485质量管理体系认证

2. 材料可追溯性—凭借广泛的材料可追溯性，可随时获得证明已遵循经过验证的制造流程的证据。

3. 文档—您需要提供所需质量检查的证据。分析证书(COA)是一个重要的证据。批次记录也很重要，因为它允许审计的可追溯性和遵守法规的证明。

4. 批间一致性—除了可靠的结果外，可重现的结果对于客户的成功至关重要，默克寡核苷酸批次间都具有相同的质量。

5. 周转时间—尽快收到您的订单是保持您自己的运营符合计划所必需的。我们简化的运营确保您的寡核苷酸能够尽快制造和交付。

6. 制造能力—如果无法快速开始生产订单，就无法确保快速交付寡核苷酸。作为一家新的cGMP供应商，我们目前有能力处理具有挑战性的项目。

7. 扩展能力—您的试剂盒或检测方法已经或将会成功，或者您需要更多的原材料用于临床前研究。我们有能力与您一起扩展，无论是从研发到商业化以外的增长，还是对更大规模研究的需求。

8. 供应链支持—您可能需要更新或面临挑战。我们的客户和技术服务团队可以为您提供帮助。如果您的操作规模较小，则可能需要法规帮助。我们的全球团队可能能够提供帮助。

默克实力

作为商业化寡核苷酸产品的一部分，定制cGMP寡核苷酸具有一致性和最高质量。无论您是想将qPCR，等温扩增，NGS或其他技术的检测方法商业化还是开发，我们的产品都能在广度和深度之间取得适当的平衡。

最终产品质检

除了在制造过程中内置了许多质量检查外，最终产品还会经过以下检验。

标准质量控制：

• 通过质谱法进行序列验证

• 通过紫外光谱进行定量分析

• 进行外观检查

质量检测：

• 通过HPLC进行纯度验证

• DNase/RNase测量

• 内毒素检测