《食品科学》：南京工业大学李莎教授等：毕赤酵母高效合成甜味蛋白Brazzein|蔗糖|培养基|蛋白质|亿活菌添加量

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甜蛋白是一类天然存在的甜味蛋白质，其甜度是等浓度蔗糖的千倍甚至万倍，同时热量低、甜味持续时间长且可被降解为氨基酸以供人体吸收利用，在食品工业中具有广泛的应用前景。目前已从自然界的植物中分离出了8 种甜味蛋白，分别为Brazzein、Monelin、Thaumatin、Mabinlin、Pentadin、Curculin、Miraculin与Neoculin。

Brazzein，中文被译为布拉奇因或巴西甜蛋白，是1994年从非洲西部野生植物

Baillon的果实中分离提纯出的一种甜味蛋白质。Brazzein由54 个氨基酸残基组成，包含8 个半胱氨酸，分子质量为6.5 kDa，其甜度约为等质量蔗糖的2 000 倍，同时具有良好的水溶性。由于Brazzein只能从野生植物的果实中提取得到，且其在果实中的含量较低，传统种植提取手段成本高昂，因此通过基因工程技术实现天然甜味蛋白的异源表达愈发受到关注，目前研究者们已经在大肠杆菌中实现了Thaumatin的表达，但会导致蛋白以包涵体的形式存在，需要进一步进行复性；Monellin则由重组毕赤酵母在5 L生物反应器中发酵产生，产量达到了2.45 g/L，可以认为真核生物是异源表达甜味蛋白的理想系统。

南京工业大学的高鹏、张胜梦、李莎*等通过优化毕赤酵母

GS115表达系统和摇瓶水平优化，确定最佳诱导条件，并进行启动子筛选实验、信号肽适配性验证与共表达蛋白表达调控元件以进一步提高Brazzein产量。最后在5 L发酵罐中，对发酵工艺与培养基进行优化，以期为Brazzein的工业化生产提供高效技术方案。

1 构建异源表达Brazzein的重组毕赤酵母与摇瓶发酵条件优化

构建得到重组质粒pPIC9K-Bra（图1a），电转获得大量转化子，提取其基因组后对目的片段进行PCR扩增验证，结果在650 bp处均显示目的条带，测序结果证明无误，表明

基因被成功整合到毕赤酵母GS115基因组上（图1b）。重组工程菌进行甲醇诱导表达，离心取上清液进行SDS-PAGE，在6.5 kDa处有明显的蛋白条带，与理论分子质量大小一致（图1c）。经质谱鉴定，为Brazzein的特征肽段。以上结果证实，毕赤酵母异源表达Brazzein的阳性转化子

-1成功获得。

-1表达甜味蛋白Brazzein的摇瓶发酵条件进行了单因素优化。甲醇诱导体积分数设置为2.0%时，虽然生物量不是最高，但蛋白质量浓度可达到80.8 mg/L，相比0.5%诱导的产量提升了217.5%（图1d）；初始生物素体积分数为0.08%时蛋白表达量最高，为82.4 mg/L，且可以保持最高的生物量（图1e）；发酵温度为30 ℃时Brazzein表达量最高，达到85.1 mg/L，过高或者过低的温度都不适宜异源蛋白的表达与生物量的积累（图1f）；BMMY培养基的初始pH值为6.0时最适宜重组菌生长与目的蛋白表达，表达量提高至90.2 mg/L，实现了蛋白表达与生物量积累的平衡（图1g）。经4 个单因素的发酵条件优化，Brazzein在摇瓶水平上表达量提升了254.3%。

2 Brazzein异源表达的启动子优化

基于毕赤酵母

GS115基因组和文献报道，挖掘获得6 种内源性诱导型启动子（PAOX1、PCAT1、PADH3、PFLD1、PDAS1、PFDH1）和3 种内源性组成型启动子（PGAP、PKAR2-1U＋GCW、PKAR2-3U＋GCW），构建了目的基因

的表达质粒pPIC9K-pro-

（图2a），并转化构建重组菌

-1～9。在诱导表达后取样检测OD600和发酵上清液的蛋白质量浓度，并进行SDS-PAGE分析，结果如图2b所示，各启动子优化菌株的蛋白表达效率如图2c所示。发酵结果表明经过120 h的诱导后，PAOX1优化菌株的Brazzein表达量最高，达到90.21 mg/L，且生物量最低，

-1重组菌具有最强的单位菌体表达水平，这也预示着PAOX1在后续菌株改造中最富有潜力，刘超等使用PAOX1与其他6 种强启动子异源表达人源III型胶原蛋白，结果表明PAOX1较其他强启动子具有更高的表达效率与浓度，本研究结论基本与其相符。相比之下，PADH3、PFLD1和PCAT1表达效果均不佳，这可能由于不同启动子与目的蛋白的适配性有关。因此，后续仍然以PAOX1作为Brazzein诱导型启动子的菌株

-1进行实验。

3 Brazzein异源表达的信号肽适配性优化

信号肽是位于蛋白质N端的一段氨基酸序列，在蛋白分泌表达中扮演着至关重要的角色。经挖掘得到6 个外源信号肽（Sα-factor、SαΔ57-70、SLysozyme、SeSIG、Sost1、Sost1-proα）和3 个内源信号肽（Sdan4、Sdddk、Smsb2）（图3a），分别构建重组菌

-10～17。结果表明（图3b、c），S α-factor 、S ost1-proα 、S Lysozyme 、S eSIG 和S msb2 对Brazzein的分泌表达效果基本一致，表达量均在79.5～85.8 mg/L之间。而重组菌K. phaffii Bra-11上基于S α-factor 改造的S αΔ57-70 表达量最佳，达到183.2 mg/L，相比S α-factor 的表达水平提高了约113%，且生物量可以维持在一个较高的水平。S α-factor 第57～70氨基酸的突变使信号肽中第3段

-螺旋部分缺失，增加了信号肽环区的柔性，该柔性有利于信号肽与内质网上的受体更好地相互作用，且信号肽能够更有效地与新合成蛋白质相互作用，帮助它正确高效地进行跨膜运输，从而促进蛋白的表达。相较于S α-factor 改造策略，S ost1-proα 的组合式改造策略也有所提高，S ost1-proα 是通过将S α-factor 的前区序列替换为S ost1 的前区序列，相比原始S ost1 能够更有效地促进目的蛋白质的翻译后转位进入内质网，从而提高分泌效率，但在本研究中表达量仍与S α-factor 相差不大。另外，2 个内源信号肽S dan4 和S dddk 不适用于Brazzein的分泌表达，相比S α-factor 下调62.5%和53.7%。因此，选取以S αΔ57-70 替代S α-factor 作为Brazzein的分泌信号肽的重组菌

-11进行下一步研究。

4 蛋白结构修饰及内质网压力释放对Brazzein异源表达的影响

蛋白二硫键异构酶（PDI）能够催化蛋白质中二硫键的形成、断裂和重排，从而促进蛋白质的正确折叠；转录因子Hac1在内质网中积累大量未折叠或错误折叠的蛋白质时，被激活并转移到细胞核，诱导蛋白质折叠相关基因的表达；伴侣蛋白BiP在蛋白质转运到内质网的过程中发挥重要作用，防止新合成的蛋白质在转运过程中变性或断裂，3 种蛋白表达调控元件在蛋白分泌表达过程中的具体机制如图4a所示。

-11作为对照菌株，与分别整合分子伴侣和转录因子PDI、Hac1、BiP的

-18～20菌株进行比较。对照菌株表达量为175.1 mg/L，整合PDI的菌株

-18表达量为209.3 mg/L，相比之下提升19.5%，而整合

的菌株

-20表达量变化不显著，且3 种分子伴侣和转录因子对于生物量的影响也不显著（图4b、c）。PDI可以通过催化二硫键的形成和异构化，帮助异源蛋白在内质网中正确折叠，从而提高蛋白的表达量，如共表达PDI可以使抗体蛋白2F5 Fab在毕赤酵母中的表达水平提高2 倍，因此选择重组菌

-18进行后续的发酵罐放大验证，以评估其在高密度发酵中的生长性能和产物生成能力。

5 5L发酵罐高密度培养表达Brazzein工艺优化

5.1 甲醇诱导起始生物量对Brazzein表达量的影响

通过调整甘油补料时间的长短控制诱导前发酵罐中毕赤酵母的生物量（以OD600表征），以重组工程菌

-18为研究对象，考察不同初始生物量（OD 600 ＝100或200）进行甲醇诱导对Brazzein表达量的影响。结果表明，诱导起始OD 600 为200时，表达量可在108 h到达峰值，约为0.7 g/L，而当诱导起始OD 600 为100时，蛋白前期积累速度较慢，但表达量可以在114 h达到约1.0 g/L，并且在相同时间点产蛋白的速率均为最高（图5）。这表明起始生物量较高并不一定能提高异源蛋白的表达量，即使在诱导初期效果也不一定好，这可能由于毕赤酵母高密度发酵对于DO的要求较高，生物密度大造成传氧受阻。因此，后续研究中甲醇诱导起始生物量OD 600 定为100。

5.2 发酵过程pH值调控对Brazzein表达量的影响

研究表明，毕赤酵母适宜生长的pH值较为宽广，在pH 3～7的范围内均能保持良好的生长趋势，但为了高效表达异源蛋白，发酵pH值一般控制在6左右。因此，本研究在确定初始生物量的基础上，通过流加氨水控制发酵过程pH值分别为4、5、6和7，考察其对

-18菌株表达Brazzein产量的影响。结果表明，pH 4、5、6和7的最高表达量分别为1、1.4、1.1、0.9 g/L（图6）。这表明pH值远离7时，促进Brazzein的分泌表达，这可能是由于Brazzein的等电点为6.98，发酵液pH值远离等电点有利于Brazzein的可溶性表达。但过于酸性的环境，降低了重组菌在发酵后期（96～126 h）的生长状态与蛋白表达量，其OD 600 值低于pH值为6时的数值。因此，选择将发酵过程pH值控制在5。

5.3

-18菌株高密度发酵表达Brazzein的生产初探

由于BMGY培养基中含有酵母提取物、YNB、蛋白胨等昂贵的氮源，规模化生产培养基成本较高，而BSM培养基成分则相对简单，主要包含无机盐、甘油等基本营养物质，可以显著降低原料成本。以重组工程菌

-18为研究对象，根据上述优化的条件采用BSM培养基进行高密度发酵的研究，结果如图7所示，可以在126 h获得1.2 g/L的产量，略低于BMGY培养基的表达效果，但可以实现更高的生物量积累，如若后期再进行适配性代谢及发酵过程优化，那么使用BSM工业化培养基生产甜味蛋白Brazzein的潜力很大，另一方面也表明本研究创制的这株重组菌具有多元的发酵适应性，可适用于多种培养基配方。

通过毕赤酵母宿主表达体系组合优化及发酵过程强化，本研究在5 L生物反应器中，以BMGY和BSM为培养基，通过分批补料策略，分别获得1 440、1 220 mg/L的Brazzein表达量，相较于摇瓶水平使用

GG799作为表达宿主的104 mg/L表达量和发酵罐水平使用

GS115作为表达宿主的1 000 mg/L表达量提升明显（表2）。

5.4 重组Brazzein的纯化与鉴定

因为发酵液上清在50 kDa附近存在一定的杂蛋白条带，所以离心后取上清液，使用分子质量10 000 kDa的超滤管截留剩余杂蛋白，通过图8可知，最终可以获得纯度较高的目的蛋白。

质谱分析结果中匹配到4 条注释序列：CQLANQCNYDCK、KVYENYPVSK、SGECFYDEKR、VYENYPVSKCQLANQCNYDCK（表3），序列覆盖度为94%，说明毕赤酵母中表达的蛋白与目标蛋白Brazzein相匹配。

随机提供给志愿者A、B、C、D、E 5 种样品，对不同质量浓度的重组蛋白Brazzein和蔗糖进行双盲感官检验，通过排序法按照甜度高低对样品进行排序。由评价结果可知（表4），有8 名志愿者认为75 μg/mL的蛋白样品溶液甜度与10 000 μg/mL蔗糖无明显差异，因此计算可得重组蛋白Brazzein的甜度约为等质量蔗糖的150 倍，与目前已知最高产量为等质量蔗糖的40 倍的甜度结果相比，本研究结果较其提升275%。另外，虽有2 位志愿者认为重组蛋白Brazzein的甜度介于100～150 倍之间，但其后味与持久性显著强于蔗糖。目前已知甜味蛋白Brazzein甜度约为等质量蔗糖的2 000～3 000 倍，实验结果与其存在一定差距，可能的原因是毕赤酵母表达系统存在的糖基化修饰，会影响众多外源蛋白的活性，另外甜味蛋白的甜味依赖其正确的构型，共表达PDI后虽然可以实现甜味蛋白Brazzein的高效表达，但仍缺少其构型与天然来源蛋白构型的对比，这依赖于异源重组表达与天然表达Brazzein的晶体结构差异分析，后续也需要研究毕赤酵母的糖基化、磷酸化等修饰机制与甜度的关系，通过基因工程或发酵条件优化，调整修饰模式和程度，使甜蛋白的修饰更接近天然状态，提升甜度。

结论

甜味蛋白作为非糖甜味剂，其甜度是等浓度蔗糖的千倍以上，同时热量低、甜味持续时间长且可被降解为氨基酸以供人体吸收利用，因此具有广阔的发展前景。本研究成功构建了毕赤酵母重组工程菌

-1，并对其进行了系统地发酵过程单因素优化。证实2.0%的甲醇、0.08%的初始生物素、30 ℃的培养温度和6.0的初始pH值能够显著提高摇瓶条件下Brazzein的表达量。进一步的研究中，通过替换和改造启动子及信号肽，确定了启动子P AOX1 和信号肽S αΔ57-70 为最优选择，进一步共表达分子伴侣PDI后获得了显著提高Brazzein表达量的毕赤酵母重组工程菌

-18。扩大生物反应器规模至5 L，通过优化发酵起始生物量和诱导期pH值后获得1.4 g/L的蛋白表达量，并探索了BSM工业化培养基在甜味蛋白表达中的潜力，最终可以获得1.2 g/L的产量，本研究为进一步推动甜味蛋白走向工业化生产提供了异源表达强化策略和优质的发酵种质资源。

本文《毕赤酵母高效合成甜味蛋白Brazzein 》来源于《食品科学》2025年46卷第17期111-119 页，作者：高鹏，张胜梦，孙元伟，黄巍巍，邱益彬，徐虹，张琦，李莎* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250311-087 。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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