FSHW | 太平洋牡蛎精氨酸激酶（一种主要过敏原）的致敏性及交叉反应性分子机制

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Abstract

作为一类重要的贝类，牡蛎可引发严重的过敏反应。本研究旨在鉴定并表征太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中的主要过敏原，并阐明其致敏性及交叉反应性的分子机制。天然及重组太平洋牡蛎精氨酸激酶（AK）均表现出显著的免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白E（IgE）结合活性。热处理及强酸性、强碱性条件可降低太平洋牡蛎AK的IgE结合活性。此外，研究证实了精氨酸激酶在不同贝类物种间存在交叉反应性。在本研究鉴定出的7个表位肽中，P2肽段决定太平洋牡蛎AK的特异性，而P3肽段则介导软体动物与甲壳类动物间的交叉反应。进一步研究发现，轻链中的谷氨酸98（Glu98）、组氨酸 31（His31）以及重链中的精氨酸 101（Arg101）、赖氨酸 57（Lys57）是识别表位过程中的关键IgE结合残基。这些研究结果为贝类过敏的预防与治疗，以及低致敏性贝类产品的研发提供了新的思路。

Introduction

贝类过敏是一种典型的IgE介导的食物过敏，在美国，其在儿童中的发病率为0.06%～2.00%，在成人中的发病率为1.69%～9.00%。软体动物是贝类中的重要类别，包含牡蛎、扇贝、蛤蜊、鸟蛤和贻贝等。其中，牡蛎是人类健康饮食的重要组成部分，也是优质蛋白质的重要来源。在全球范围内，牡蛎（尤其是太平洋牡蛎）的产量和消费量逐年递增。然而，软体动物可能诱发IgE介导的食物超敏反应，进而引发严重的过敏症状，包括哮喘、荨麻疹、胃肠道痉挛，甚至休克。据统计，美国儿童群体中软体动物过敏的患病率约为0.15%，东南亚地区为0.2%，法国则超过1.5%。尽管如此，目前针对软体动物过敏的研究仍较为匮乏。

迄今为止，世界卫生组织与国际免疫学会联合会（WHO/IUIS）已将原肌球蛋白（TM）列为软体动物物种中的过敏原，例如太平洋牡蛎（过敏原编号Cra g 1）和美洲牡蛎（过敏原编号Sac g 1）。原肌球蛋白是一种盐溶性、热稳定性的肌原纤维蛋白，分子量为34～36 kDa，已被证实是贝类中主要的IgE结合型过敏原。然而，以往研究表明软体动物中还存在其他过敏原，这些过敏原仍需进一步鉴定与研究。鉴于太平洋牡蛎的年产量与消费量逐年增加，迫切需要对其主要过敏原进行分析，以更深入地了解牡蛎过敏机制，并加强牡蛎过敏原的管理工作。

已有研究报道，在对虾过敏人群中，软体动物（鲍鱼、海螺、贻贝、栉江珧、蛤蜊、乌贼、鱿鱼和章鱼）与甲壳类动物（对虾、龙虾和螃蟹）之间存在交叉反应性。交叉反应性的产生，取决于不同贝类物种中共同过敏原的高序列相似性及相似的构象表位。TM已被证实是贝类中的共同过敏原，也是导致牡蛎与甲壳类动物间产生交叉反应性的关键物质。然而，此类交叉反应性可能涉及软体动物与甲壳类动物中大部分的共同过敏原。AK被认为是多种甲壳类动物中的另一类主要过敏原，同样参与介导软体动物与甲壳类动物间的交叉反应性。目前已观察到螃蟹AK与章鱼、螯虾及对虾AK之间存在交叉反应性，但贝类物种间交叉反应性的分子机制仍不明确。免疫学研究表明，线性表位和构象表位共同决定了过敏原的免疫原性，这为进一步理解交叉反应性提供了思路。

在本研究中，研究人员利用牡蛎过敏患者的血清，对太平洋牡蛎蛋白质提取物的IgE结合反应性进行了谱图分析。通过质谱分析，将一种具有IgE反应性的40 kDa蛋白质鉴定为肌肉蛋白—AK。为更深入地了解太平洋牡蛎AK，研究人员分析了该牡蛎过敏原AK的理化特性（如热稳定性、pH稳定性、IgG/IgE结合活性及蛋白质结构）。此外，研究还评估了太平洋牡AK与其他甲壳类动物AK的交叉反应性，并进一步模拟了IgE与太平洋牡蛎AK之间的分子相互作用，旨在为太平洋牡蛎过敏及甲壳类动物交叉反应性提供理论依据。

Results

C. gigas中的特异性IgE反应谱

本研究通过Western blot测定了牡蛎蛋白质的IgE结合能力。首先采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在生牡蛎蛋白质提取物中观察到16条蛋白质条带，分子量范围约为16～210 kDa。此外，利用6份牡蛎过敏患者血清，通过Western blot测定了这16条蛋白质条带的IgE结合能力。在图1A中共观察到9条具有IgE反应性的条带，对应分子量分别为18、38、40、55、70、90、95、100和120 kDa的蛋白质。其中，40 kDa蛋白质的致敏概率最高（6份血清中有5份可与其结合），提示该40 kDa蛋白质可能是太平洋牡蛎中的主要过敏原。

为鉴定该40 kDa蛋白质，研究人员切取了分子量为40 kDa的IgE结合条带，并通过液相色谱-串联质谱对其进行分析。在UniProt数据库的牡蛎（C. gigas）子库中，该40 kDa蛋白质共产生20条有效肽段，这些肽段与AK（登录号：K1PLF9）匹配，且与AK的比对氨基酸序列一致性达70%。因此，在C. gigas中，AK具有最高的IgE结合能力。

图1 牡蛎过敏患者对C. gigas蛋白质提取物的IgE反应模式及C. gigas-nAK与C. gigas-rAK的IgG/IgE结合活性

C. gigas-AK的纯化与表达

天然精氨酸激酶（nAK）通过DEAE-Sepharose纯化获得：一条分子量为40 kDa的AK单一条带。重组精氨酸激酶（rAK）经大肠杆菌 BL21（E. coli BL21）表达获得，其纯度可达95%以上。

AK是太平洋牡蛎中的主要过敏原

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot对C. gigas-nAK和rAK的IgE和IgG结合活性进行了分析，发现C. gigas-AK具有显著的IgE和IgG结合能力，该结果与Western blot的分析结果一致。在图1C中，nAK和rAK均呈现出清晰的阳性条带，而牛血清白蛋白（BSA）与混合阳性血清及anti-AK mAb均未发生反应。因此，可得出结论，AK是C. gigas中的主要过敏原。

C. gigas-nAK的二级结构

nAK的二级结构组成如下：α-螺旋占比63.4%、延伸链占比3.3%、β-转角占比15.4%、无规卷曲占比17.9%。nAK中芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸）含量较低。

C. gigas-nAK的特性分析

如图2A所示，当温度从65 ℃升高至100 ℃时，nAK的IgE结合活性逐渐下降。在pH稳定性分析中，nAK的IgE结合活性在弱酸性与弱碱性条件下（pH 6.0～9.0）相对稳定；然而，在强酸性（pH 1.0～3.0）与强碱性条件下（pH 10.0～11.0），nAK的IgE结合活性显著下降（图2B）。

图2C. gigas-nAK的特性分析

不同物种AK的交叉反应性分析

如图2C所示，C. gigas-nAK含有可结合虾特异性IgE的大部分IgE结合表位。

如图2D所示，所有物种可分为2个聚类：软体动物类（牡蛎与章鱼）和节肢动物类（蟹、虾、龙虾及蟑螂），这表明C. gigas-nAK与中国枪乌贼及普通章鱼的AK亲缘关系更近。

IgE识别表位的分子机制

体外实验验证结果显示，这7个C. gigas-AK表位均能在嵌合IgE的抗原识别位点与IgE结合（图3）。IgE与P3表位的结合作用最强，原因是二者相互作用时可掩埋145.2 Å2的表面积，且该表位肽的弯曲程度最大—其N端与C端的距离缩短了39.8 Å。值得注意的是，所有表位肽与IgE结合后均未表现出β-折叠或平面结构特征，这与以往的研究结论存在差异。

图3 C. gigas-AK表位肽与嵌合IgE的详细相互作用

不同处理方式对表位构象的影响

如图4显示，经热处理后，7个C. gigas-AK表位均发生结构变化：其RMSD值范围为1.384～4.783 Å，溶剂可及表面积（SASA）变化范围为减少40.92 Å2至增加27.17 Å2。经酸性处理后，这些表位同样发生结构变化：RMSD值范围为1.820～4.604 Å，SASA变化范围为减少90.85 Å2至增加41.73 Å2。而经热酸联合处理后，表位的结构变化表现为：RMSD值范围为2.191～4.332 Å，SASA变化范围为减少32.6 Å2至增加11.5 Å2。总体而言，热酸联合处理会导致这些表位肽的结构偏差更显著，而单独热处理则会使表位的SASA暴露程度更高。

图4无配体结合（apo-）及IgE结合状态下C. gigas-AK天然表位肽与处理后表位肽的结构比对

Discussion

随着牡蛎产量的增加及大规模消费，由软体动物引发的过敏反应也随之增多。然而，目前针对软体动物（尤其是最常见的牡蛎品种—C. gigas中致敏蛋白的研究尚为数不多。本研究利用牡蛎特异性IgE，对C. gigas中的潜在致敏蛋白进行了筛选与鉴定。在免疫印迹分析中，9条具有IgE反应性的条带里，经鉴定为AK的40 kDa蛋白质展现出最高的致敏概率（6份过敏血清中有5份可与其结合），这表明AK是C. gigas中的主要致敏蛋白。因此，本研究将重点聚焦于C. gigas-AK。研究人员纯化得到nAK，并在大肠杆菌（E. coli）中表达获得rAK。免疫印迹与ELISA结果显示，rAK的IgE和IgG结合活性均强于nAK。可能的解释是，nAK的翻译后修饰掩盖了其IgE和IgG结合位点。上述结果证实，AK确实是C. gigas中的一种致敏原。

此外，已有研究表明，精氨酸激酶在章鱼、甲壳类动物及蟑螂中均为重要致敏原。因此，AK可被认定为C. gigas中的主要致敏原，该发现为牡蛎过敏的预防与治疗提供了新的思路。

通过牡蛎特异性IgE和虾特异性IgE的icELISA可知，牡蛎与甲壳类动物之间存在交叉反应。有趣的是，C. gigas-AK与虾特异性IgE的结合活性，强于甲壳类动物AK与牡蛎特异性IgE的结合活性。其原因可能是，患者在摄入牡蛎或虾后，血清中牡蛎特异性IgE的水平通常显著低于虾特异性IgE的水平。这些研究结果表明，C. gigas-AK包含了其他甲壳类动物AK上存在的大部分IgE结合表位。因此，我们对C. gigas-AK表位肽与虾特异性IgE之间的分子相互作用展开了研究。研究发现，线性表位P3与虾特异性IgE的结合亲和力最高，而表位P2则具有最强的牡蛎特异性IgE结合能力。这很可能是因为，位于AK保守区域的表位P3，在多种甲壳类动物中也被鉴定为表位，这表明P3在C. gigas-AK与甲壳类动物AK的交叉反应中发挥着关键作用。相反，位于非保守区域的表位P2，则被证实是C. gigas-AK特异性的重要表位。

以往研究证实，大多数过敏原在不同温度或pH值条件下仍能保持免疫反应性。对nAK的热稳定性与pH稳定性研究表明，C. gigas-AK稳定性较差，在高温（＞65 ℃）及强酸碱条件下会发生降解，进而导致其IgE结合活性下降。然而，本研究同样观察到，经酸性和热处理后，nAK仍保留一定的免疫原性。其原因可能是不同处理方式会导致构象表位发生不同变化，同时也会对部分线性表位产生影响。在本研究中，通过计算机模拟发现，加热会降低C. gigas-AK表位的免疫原性，且大多数表位肽的免疫原性也会随之下降。体外实验显示，酸性处理同样会降低其免疫原性；同时计算机模拟结果也表明，大多数表位肽与IgE的结合亲和力会因酸性处理而降低。已有研究指出，加热（尤其是煮沸）会降低虾提取物与IgE的结合能力，但会增强煮沸后虾体内纯化的TM与IgE的结合能力。因此，具体的加热和酸性处理方式可能需根据每个表位肽的序列及其在AK上的位置来确定，这为低致敏性贝类产品的研发提供了新的思路。

通过计算分析发现，轻链中的Glu98和His31，以及重链中的Arg101和Lys57，是通过氢键作用识别表位的关键IgE残基。而轻链中的Glu98、Thr99、Tyr37、His31、Leu97，以及重链中的Ala104、Thr105、His59、Lys57，则是通过疏水相互作用识别表位的关键IgE残基。其中，在所有检测条件下，轻链中的Glu98不仅能与C. gigas-AK的所有表位形成氢键，还能与这7个表位均形成疏水相互作用，这表明该残基在IgE识别甲壳类动物表位的过程中发挥着核心作用。该Glu98来源于一名中国虾过敏患者的IgE序列。

Conclusion

综上所述，本研究证实AK是C. gigas中的主要过敏原，这表明AK可用于软体动物过敏患者的体外诊断。此外，牡蛎与甲壳类动物AK之间存在的交叉反应，为贝类过敏的预防与治疗提供了新的思路。再者，热处理及强酸碱处理可降低AK的免疫原性，这为低致敏性贝类产品的研发提供了指导依据。

Molecular basis of the allergenicity and cross-reactivity of a major allergen-Crassostrea gigas arginine kinase

Yanbo Wanga,1, Peiao Zhangb,1, Jinru Zhoua, Jihui Gaob, Jinlyu Sunc, Di Wud, Wentong Xueb, Dong Yangb,*, Linglin Fua,*

a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

b College of Food Science & Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

c Allergy Department, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

d Institute for Global Food Security, School of Biological Sciences, Queen’s University of Belfast, Belfast BT9 5DL, United Kingdom

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

As an important shellfish group, the oyster can induce severe allergic reactions. We aimed to identify and characterize the major allergen in Crassostrea gigas, and elucidate the molecular basis of its allergenicity and cross-reactivity. The native and recombinant C. gigas-arginine kinase (AK) displayed significant immunoglobulin (Ig)G- and IgE-binding activity. The IgE-binding activity of C. gigas-AK could be reduced by thermal treatment and strong acidic and alkaline conditions. Besides, cross-reactivity of AK was demonstrated between shellfish species. Among seven epitope peptides identified here, P2 is responsible for the specificity of C. gigas-AK, while P3 is responsible for cross-reactions between mollusks and crustaceans. Furthermore, Glu98 and His31 in the light chain, Arg101, and Lys57 in the heavy chain are identified as key IgE residues in recognizing epitopes. These findings provide new insights into the prevention and treatment of shellfish allergy and the development of hypoallergenic shellfish products.

Reference:

WANG Y B, ZHANG P A, ZHOU J R, et al. Molecular basis of the allergenicity and cross-reactivity of a major allergen-

Crassostrea gigas

翻译： 王立磊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意