EBF：全血稳定性研究在生物样品分析方法学验证中的建议更新（2025）

采用血浆/血清开展生物样品分析方法学稳定性测试非常常见。不过，在生物样品离心之前，样本采集时的基质（全血）本质上与血浆/血清是不同的。也就是，血浆/血清只能代表离心后样本，不能说明从人体/动物采集的血液在运输、离心等前期环节中的稳定性情况。

欧洲生物分析论坛（EBF）2008年进行过一项调研，只有少数公司在常规进行小分子的方法验证或方法开发时会包括全血稳定性，而对于大分子，几乎没有任何公司开展。据EBF成员反馈，与血浆/血清稳定性数据相矛盾的全血稳定性数据的发生率很低。言外之意，待测药物在血浆/血清中稳定，在全血中应该也是稳定的。然而，其实自2001年以来，FDA关于生物分析方法验证的监管指导（Guidance for Industry-Bioanalytical Method Validation）就指出“稳定性程序应评估在样本采集和处理过程中分析物的稳定性”。EMA在相关指南（Draft Guideline on Validation of Bioanalytical Methods）中也提到“应充分关注采血后样本基质中分析物的稳定性”。

中国药典2020版《生物样品定量分析方法验证指导原则》中指出，应特别关注受试者采血时，以及在储存前预处理的基质中分析物的稳定性，以确保由分析方法获得的浓度反映受试者采样时刻的分析物浓度。ICH M10也建议进行全血稳定性测试，即样品从受试者采集之后到储存之前，应该充分关注样品基质（全血）中待测物的稳定性。

开展全血稳定性的挑战之一，许多生物分析专家认为血浆稳定性是血液稳定性的可接受替代品，例外情况非常罕见，仅限于某些已知的化合物类别，如N-氧化物或羟肟酸。不过，有证据表明血浆稳定性可能不是血液稳定性的良好指标。血液和血浆稳定性不匹配的情况占5%左右。挑战之二来自新鲜空白血液的可用性问题。另外，分析物在血细胞和血浆之间达到分布平衡的时间未知。还有一点，是否应像处理血浆/血清数据那样对全血分析方法进行验证，或者是否需要额外的准确度和精密度数据来证明在全血中进行的测量与在血浆中进行的测量同样可靠。

自2008年以来，EBF内部进行了密集的讨论，努力对作为血浆/血清方法开发和验证一部分的药物全血稳定性测试的时机、流程、问题等达成一致。从时间角度，最初只有少数公司参与这些实验，但随着时间的推移，EBF成员公司逐渐增加了对血液稳定性的常规测试。从科学角度而言，确保样本中的分析物浓度从采集点到生成血浆/血清基质的样品过程中得以保持，全血稳定性评估至关重要。

EBF在2011年首次发布了关于全血稳定性测试的建议，并在2025年做了进一步更新，以下是具体介绍。

关于新鲜血液的供应：尽管生物分析人员在确保新鲜血液供应方面存在困难，但EBF内部调查显示，对于许多公司来说，这似乎并不是一个主要障碍。然而，关于“新鲜”血液的定义以及在实验进行时血液应该有多新鲜是一个核心问题。2011年，EBF绝大多数观点认为，如果在采集后的24小时内使用，并且使用与血浆分析中相同的抗凝剂，则血液可以被视为新鲜的。当然，血液不应被冷冻。即使在冷藏或冰上保存，也不应超过建议的时间。建议在添加样品前将血液预热至37℃，以模拟生理条件。不过，2011年这版建议对于EBF社区的许多成员来说执行起来极为困难，尤其是对于临床前血液，因为这些血液需要购买并运输到生物分析现场。此外，对于24小时的时间限制也没有科学依据。2025年更新后的建议是，如果血液在采集后5天内冷藏并使用，则可以被视为新鲜的。

实验操作细节：2011年，EBF许多专家建议向血液中添加测试化合物（体外添加）的血液样本进行稳定性测试，然后将这些样本离心以收集血浆，进而使用现有的经过验证的血浆分析方法来分析这些血浆样本。当然，如前文所述，在将测试化合物添加到血液中时，血液应被加热至37℃。分析全血稳定性样本的实验过程可能是通过添加乙腈或类似溶剂来沉淀蛋白质，这些溶剂最好含有内标。在收集了所有稳定性时间点的样本后，可以测量上清液，并将结果与零时间点获得的参考值进行比较。2025年，更新后的建议是在全血中比较稳定性时间点与零时间点的峰面积比。

体外平衡时间的确定：尽管平衡通常很快，但并非瞬间完成。在EBF内部讨论中，认为有些化合物需要孵化15分钟或更长时间才能达到平衡。虽然这样的例子可能很罕见，但应明确强调，作为实验设计的一部分，建议估计必要的孵化时间。

浓度水平、重复次数和接受标准：对于存在争议的其他主题，如测试多少浓度水平、进行多少重复以及生成的数据的接受标准是什么。EBF认为，血液稳定性测试的接受标准应与血浆稳定性测试中应用的标准相同。

种属：2011年，EBF建议全血稳定性实验将首先在一个种属中进行，只有在观察到不稳定性时，才会扩展到其他种属。2025年EBF更新后的建议是，全血稳定性测试可以在人血中进行，并且只有在人血中观察到不稳定性，或者在临床前血浆中观察到不稳定性的情况下，才扩展到临床前全血。这种方法在很大程度上克服了行业在获取新鲜临床前血液方面的挑战，并考虑了3R原则，即只有在绝对必要时才使用临床前全血。EBF经验表明，人类全血稳定性数据在监管申报中是可以接受的，以支持临床前数据。

当然，全血稳定性实验主要针对小分子分析用的色谱法。对于生物药常用的配体结合方法不适用。

引自：2025, Whole blood stability in bioanalytical method validation: updated recommendations from the European Bioanalysis Forum；2011, Blood Stability Testing: European Bioanalysis Forum View on Current Challenges for Regulated Bioanalysis

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