浙江大学ACS Nano：新型纳米疗法增强水凝胶为口腔组织修复提供协同抗菌与免疫调节新策略

口腔环境的湿润、动态特性以及复杂的微生物和免疫挑战，使得传统水凝胶在治疗口腔溃疡、牙周炎等疾病时，常面临生物粘附力不足、药物释放不可控、抗菌抗炎效果有限等瓶颈。口腔组织缺损极易受到多种病原体定植，引发过度炎症和氧化应激，阻碍组织修复。因此，开发一种能紧密贴合不规则创面、具有动态力学适应性、并能持续释放广谱抗菌及免疫调节药物的新一代水凝胶，成为口腔再生医学领域的迫切需求。

为应对这一挑战，浙江大学李晓东副研究员、罗巧洁副主任医师和陆军军医大学张建祥教授合作提出了一种纳米疗法增强的多功能水凝胶新策略。该研究首先通过静电相互作用，将具有抗炎抗氧化功能的姜黄素（CUR）与抗菌聚合物聚氨丙基双胍（PAPB）自组装成双生物活性纳米颗粒（CP NPs），两种药物的负载量均超过40%。随后，将CP NPs整合到由明胶甲基丙烯酰（GelMA）和氧化透明质酸（OHA）构成的光交联双网络水凝胶中，构建了名为GOCP的杂化水凝胶。该凝胶通过氢键、静电力和希夫碱等多种动态相互作用形成强化网络，表现出可编程的机械性能、强大的组织粘附力（约80 kPa），并能持续72小时以上协同递送CUR和PAPB，发挥抗菌、抗生物膜和免疫调节功能。相关论文以“Dual-Functional Nanotherapy-Reinforced Hydrogel for Synergistic Antimicrobial and Immunomodulatory Oral Tissue Repair”为题，发表在ACS Nano上。

研究的核心设计理念与治疗机制可通过示意图1系统展示。该图阐明了GOCP水凝胶的多重相互作用增强网络设计原理、在细胞层面通过调节炎症/氧化应激及促进巨噬细胞向M2表型极化的治疗机制、通过破坏跨膜电位导致胞质成分泄漏的抗菌机制，以及在口腔溃疡和牙周炎治疗中的应用场景。

示意图1：用于有效治疗多种口腔疾病的多重相互作用增强动态水凝胶示意图。 (A) 具有多重键合增强网络的GOCP水凝胶的设计原理。 (B) GOCP水凝胶在细胞层面的治疗机制，涉及炎症/氧化应激调节和巨噬细胞向M2表型极化。 (C) GOCP水凝胶的抗菌机制，通过破坏跨膜电位和细胞质成分泄漏介导。 (D) GOCP水凝胶在治疗口腔溃疡和牙周炎中的应用。

为了验证CP NPs本身的生物活性，研究团队对其进行了详尽的表征与功能评估（图1）。CP NPs呈现均匀的球形形貌，粒径约172.5纳米。光谱分析证实了CUR与PAPB之间强烈的静电相互作用。功能实验表明，CP NPs能剂量依赖性地清除超氧阴离子、过氧化氢、次氯酸等多种活性氧，并有效减轻脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞死亡，显著抑制白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等促炎因子的表达，展现了优异的抗氧化和抗炎潜力。同时，CP NPs对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等多种病原体表现出显著的抑菌和杀菌活性，并能有效抑制生物膜形成。

图1：多功能CP NPs的合成与表征。 (A) CP NPs制备过程示意图。 (B, C) CP NPs的尺寸分布图(B)和ζ电位值(C)。 (D, E) CP NPs的TEM (D)和SEM (E)图像。比例尺：500纳米。 (F-H) CUR与PAPB之间相互作用的光谱表征。CUR、PAPB及CUR-PAPB的FT-IR (F)、1H NMR (G)谱图以及XRD图谱(H)。 (I-K) CP NPs对不同浓度•O2−(I)、H2O2 (J)和ClO−(K)的清除作用。 (L) CP NPs在不同剂量下对DPPH•自由基随时间变化的清除能力。 (M, N) 不同处理下RAW264.7巨噬细胞的典型流式细胞术图谱(M)和定量分析(N)。 (O-R) 不同处理后RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β (O)、TNF-α (P)、MPO (Q)和MCP-1 (R)的表达水平。

在细胞机制层面，CP NPs在调节巨噬细胞功能上显示出卓越效果（图2）。它能显著降低LPS引起的巨噬细胞内活性氧积累，保护线粒体膜电位和完整性，抑制巨噬细胞的过度迁移，并成功将促炎的M1型巨噬细胞逆转为抗炎、促修复的M2型。RNA测序分析进一步揭示了其作用机制（图3），CP NPs主要通过调控肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，抑制促炎反应，增强抗氧化防御，从而协调炎症微环境。

图2：CP NPs在RAW264.7巨噬细胞中的体外生物学评价。 (A, B) 通过DCFH-DA染色显示的RAW264.7巨噬细胞内ROS水平的荧光图像(A)和定量荧光强度(B)。比例尺：20 µm。 (C, D) 通过Mito-Tracker Red染色评估的线粒体活性(C)及相应定量(D)。比例尺：低倍，20 µm；高倍，10 µm。 (E, F) 显示不同处理后巨噬细胞迁移行为的光学显微镜图像(E)和定量分析(F)。比例尺：80 µm。 (G, H) 显示iNOS、CD206和CD68表达水平的荧光染色(G)和定量荧光强度(H)。比例尺：20 µm。

图3：CP NPs在巨噬细胞中生物学活性的机制研究。 (A) UpSet图显示不同组间共同差异表达基因及其交叉关系。 (B-D) DEG亚簇分析揭示了三个DEG簇在四组中不同的表达模式。 (E) 热图展示了四组中共同DEGs的表达情况。 (F, G) DEGs的基因本体(GO) (F)和KEGG (G)富集分析。 (H) 显示TNF-α和TGF-β表达水平的代表性Western blot条带。β-肌动蛋白作为上样对照。 (I, J) TGF-β (I)和TNF-α (J)水平的定量分析。 (K, L) 巨噬细胞中TGF-β (K)和TNF-α (L) mRNA水平的qRT-PCR定量。

接下来，研究聚焦于将CP NPs工程化整合到水凝胶中（图4）。将CP NPs负载入GelMA/OHA基质后，形成的GOCP水凝胶网络结构更为致密。水凝胶的溶胀和酶降解行为得到优化，并实现了CUR和PAPB的持续、可控共释放，避免了突释现象。流变学和粘附测试表明，CP NPs的加入以浓度依赖的方式增强了水凝胶的储能模量和组织粘附强度，其中GOCP4（CP NPs浓度为0.4 mg/mL）表现出最优的综合力学性能。

图4：纳米疗法增强水凝胶的工程化与表征。 (A) 通过将CP NPs负载到GO水凝胶中制备光固化水凝胶的示意图。 (B) SEM图像展示了冻干GOCP水凝胶的断面及其数码照片。比例尺：100 µm。 (C) 含有不同浓度Cy5标记CP NPs的GOCP水凝胶的荧光图像。比例尺：10 µm。 (D) 不同GOCP水凝胶的酶降解测试。 (E, F) 含有不同含量CP NPs的GOCP水凝胶中PAPB (E)和CUR (F)的体外释放曲线。 (G, H) 不同GOCP水凝胶的流变行为(G)及定量分析(H)。G′，储能模量；G″，损耗模量。 (I, J) 不同CP NPs含量的GOCP水凝胶的粘附强度-位移曲线(I)和平均剪切强度(J)。 (K-N) GO (K)、GOCP2 (L)、GOCP4 (M)和GOCP8 (N)的触变性测试。

抗菌性能评估证实了GOCP水凝胶的实战能力（图5）。在与多种口腔常见致病菌（包括牙龈卟啉单胞菌）共培养时，GOCP水凝胶能剂量依赖性地减少细菌菌落形成，破坏细菌膜结构，导致钾离子和β-半乳糖苷酶泄漏，其抗菌效果与临床常用漱口水成分氯己定相当。

图5：GOCP水凝胶的剂量依赖性抗菌效果。 (A-E) 在不同GOCP水凝胶表面粘附的金黄色葡萄球菌(A， B)、大肠杆菌(C)、MRSA (D)和牙龈卟啉单胞菌(E)的代表性光学图像及菌落形成单位定量分析。 (F) SEM图像显示了粘附在GOCP水凝胶表面的不同细菌菌株的形态。比例尺：2 µm。 (G-N) 在不同处理下，包括金黄色葡萄球菌(G，K)、大肠杆菌(H，L)、MRSA (I，M)和牙龈卟啉单胞菌(J，N)，释放到培养基中的K+ (G-J)和β-半乳糖苷酶(K-N)的定量。

动物实验全面验证了GOCP水凝胶的治疗效果。在皮肤全层感染伤口模型中（图6），GOCP水凝胶（尤其是GOCP4）能有效抑制伤口处多种细菌定植，加速伤口闭合，降低促炎因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）水平，同时提升抗炎修复因子TGF-β的表达，并促进胶原沉积和组织再生。在更贴近临床的口腔溃疡模型中（图7），GOCP水凝胶同样显著加快了溃疡愈合速度，减轻了局部炎症反应，促进了血管生成和巨噬细胞向M2型极化。最终，在牙周炎大鼠模型中（图8），局部注射GOCP水凝胶能有效保留于牙周袋内，显著抑制牙槽骨吸收，促进骨组织再生，并调节牙周组织的炎症微环境。

图6：GOCP水凝胶在背部穿孔缺损大鼠模型中的抗菌和抗炎效果。 (A) 不同水凝胶制剂处理后，从伤口组织获得的金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌和MDRAB菌落照片。 (B-E) 金黄色葡萄球菌(B)、MRSA (C)、大肠杆菌(D)和MDRAB (E)的定量CFU计数。 (F) 用GO、GOCP2、GOCP4和GOCP8处理的大鼠伤口变化代表性图像。伤口面积轨迹（称为TWA）也已示出。 (G, H) 大鼠背部缺损伤口面积变化(G)和伤口平均直径(H)的定量分析。 (I-L) 不同处理后大鼠伤口组织中TNF-α (I)、IL-1β (J)、IL-6 (K)和TGF-β (L)的表达水平。 (M) 第21天时不同组伤口组织切片的H&E或Masson染色。比例尺：1毫米。红色虚线指皮肤穿孔器创建的缺损区域。

图7：GOCP水凝胶通过免疫调节加速口腔溃疡愈合。 (A) 显示第1天至第9天溃疡愈合过程的代表性数码图像。黄色虚线表示溃疡区域。 (B-E) 不同组中TNF-α (B)、IL-1β (C)、IL-6 (D)和TGF-β (E)的蛋白水平。 (F) H&E或Masson染色的组织切片。比例尺：1毫米。 (G) 显示VEGF、TNF-α和IL-10相对水平的代表性免疫组化图像。比例尺：1毫米。 (H) 显示iNOS或CD206（红色）表达水平的代表性荧光图像。细胞核用DAPI（蓝色）复染，而总的RAW264.7巨噬细胞用CD68（绿色）染色。比例尺：1毫米。

图8：GOCP水凝胶促进牙周组织再生。 (A) 不同组大鼠腭侧及牙槽骨矢状截面的典型Micro-CT图像。红色双箭头表示距离（称为CEJ-ABC）。 (B-E) 骨体积(BV) (B)、骨体积分数(BV/TV) (C)、连接密度(Conn.D) (D)和CEJ-ABC距离(E)的定量分析。 (F-I) 不同处理后牙周组织中TNF-α (F)、IL-1β (G)、IL-6 (H)和TGF-β (I)的表达水平。 (J) 经H&E、Masson或TRAP染色的牙周组织代表性组织学切片。黑色箭头指示牙周袋，蓝色箭头表示炎症细胞，红色箭头显示破骨细胞，黄色虚线指骨骼。比例尺：1毫米。

综上所述，这项研究成功开发了一种基于自组装纳米疗法的多功能增强型水凝胶。该平台通过纳米颗粒与水凝胶基质间的多重动态相互作用，巧妙地将强效湿态组织粘附、可调机械性能与抗菌、免疫调节药物的持续协同递送融为一体。在多种口腔疾病模型中，该水凝胶展现出构建物理屏障、长效抵御微生物入侵、精准调控局部免疫微环境和加速组织再生的协同疗效。这一策略不仅为治疗复杂的口腔炎症性疾病提供了创新解决方案，其设计理念和多功能特性也显示出应用于其他潮湿动态环境下组织修复（如鼻黏膜感染、慢性伤口等）的巨大潜力，有望满足重大的未满足临床需求。