神经环路应用（38）丨Split-Cre 重组系统在神经环路中应用

Split-Intein介导的 split-Cre 重组系统是一种高时空精度、环路特异性的基因操作工具，广泛应用于神经环路功能研究。split-Intein 介导的split-Cre重组系统是基于 “蛋白质反式剪接” 和 “病毒双向靶向转导” 的双重特异性调控策略，核心目标是让有活性的 Cre 重组酶仅在 PFC（前额叶皮层）投射至 BLA（基底外侧杏仁核）的单向回路神经元中表达，从而实现 Shank3 基因的回路特异性敲除。

原理

split-Cre 的片段化设计、Intein 的蛋白质反式剪接功能、AAV 病毒的双向靶向转导特性，三者协同确保基因操作的回路特异性。

1. split-Cre 与 Intein 的核心功能

split-Cre（片段化 Cre 重组酶）：Cre 重组酶是介导 loxP 位点间 DNA 重组的关键工具，但完整 Cre 仅需表达即可发挥作用，无法实现 “区域/回路限制”。研究将Cre重组酶拆分为N 端片段（CreN）和C端片段（CreC），单独表达的 CreN 或 CreC 均无酶活性，只有二者重新组装为完整 Cre 时才能识别 loxP 位点并介导基因敲除。

Intein（内含肽）的反式剪接功能：Intein 是一类可在蛋白质水平上自我剪接的氨基酸序列，分为 N 端 Intein（InteinN）和 C 端 Intein（InteinC）。当 InteinN 与 CreN 融合（CreN-InteinN）、InteinC 与 CreC 融合（InteinC-CreC）时，InteinN 与 InteinC 可通过自身的 “反式剪接” 特性相互识别并形成复合物，同时将 CreN 与 CreC 通过肽键连接组装为有活性的完整 Cre 重组酶，而 Intein 自身则剪接脱离，不影响Cre的功能（这一过程称为 “蛋白质反式剪接”）。

2. AAV病毒的双向靶向转导特性

顺行 AAV（AAV8-CreN-InteinN）：

AAV8 血清型具有顺行转导特性，病毒注射至神经元胞体所在脑区（如 PFC）后仅在注射区神经元胞体内表达目的基因（CreN-InteinN），且表达产物（蛋白质）仅随轴突运输至末梢，不会跨突触传递至下游脑区，确保 CreN-InteinN 仅存在于 PFC 神经元中。

逆行 AAV（AAV retro-InteinC-CreC）：

逆行 AAV 是经过改造的 AAV 血清型（如 AAVretro）具有逆行转导特性，病毒注射至神经元轴突末梢所在脑区（如BLA）后，会被轴突末梢摄取并逆向运输至神经元胞体，仅在投射至BLA的神经元胞体内表达目的基因（InteinC-CreC），确保InteinC-CreC仅存在于向 BLA 投射的神经元中。

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3. 回路特异性实现逻辑

只有同时满足以下两个条件的神经元，才能组装出有活性的 Cre 重组酶：

位于 PFC 脑区（表达 CreN-InteinN，来自顺行 AAV8 注射）；向 BLA 脑区投射（表达 InteinC-CreC，来自逆行 AAVretro 注射）。这两个条件的交集恰好是 PFC 投射至 BLA 的单向回路神经元。只有这类神经元中，CreN-InteinN 与 InteinC-CreC才能通过 Intein 反式剪接组装为完整 Cre，进而介导 Shank3 基因敲除；其他脑区神经元（如 PFC 不向 BLA 投射的神经元）仅表达单一Cre片段，无法形成活性Cre从而实现回路特异性。

split-Intein 介导的 split-Cre 重组系统结合 AAV 病毒的双向转导实现回路特异性敲除：①向 PFC 注射顺行 AAV8-CreN-InteinN 病毒，使其在 PFC 神经元胞体表达 N 端 Cre-Intein 融合蛋白（CreN-InteinN）；②向 BLA 注射逆行 AAV retro-InteinC-CreC 病毒，使其在 BLA 神经元轴突末梢表达 C 端 Intein-Cre 融合蛋白（InteinC-CreC）；③仅在 PFC 投射至 BLA 的单向回路神经元中，CreN 与 CreC 通过 Intein 介导的重组形成有活性的 Cre 酶，进而敲除条件性敲除小鼠（Shank3ⁿᵉ⁴⁻⁹）的 Shank3 基因；同时，通过 Ai-14 Cre 报告小鼠的 tdTomato 信号，验证 Cre 仅在 PFC-BLA 回路中表达。

优势

传统全脑 Shank3 敲除会导致多个脑区（如纹状体、海马）的基因缺失，难以区分是哪个脑区或回路的突变导致社交障碍；而回路特异性敲除可精准定位 PFC-BLA 回路，排除其他脑区/回路的干扰，明确该回路中 Shank3 突变与社交行为的直接因果关系，提高研究的空间特异性和机制解析的精准度。

案例简析

Fig1 PFC-BLA回路特异性Shank3敲除对神经元形态的影响

回路特异性 Cre 表达验证：

通过向 Shank3f/f:Ai-14 小鼠的 PFC 注射 AAV8-CreN-InteinN、BLA 注射 AAV retro-InteinC-CreC仅在 PFC-BLA 单向投射神经元中检测到 tdTomato 信号（Cre 报告信号），证实 Cre 仅在目标回路中活性实现 Shank3 特异性敲除；

神经元形态异常：

3D 重建分析显示，ctMUT 小鼠 PFC神经元的初级树突数量减少，树突棘密度增加、长度缩短、头部尺寸减小，明确回路特异性 Shank3 敲除导致的形态学缺陷。

选择该系统实现回路特异性敲除原因

高特异性：相比传统区域特异性Cre小鼠（如 PFC-Cre 小鼠，可能在PFC非 BLA 投射神经元中也表达Cre），该系统通过顺行+逆行 AAV+Intein剪接的双重限制，实现了回路水平的精准靶向，避免其他脑区/神经元的干扰。

灵活性高：无需构建复杂的转基因小鼠品系，仅通过病毒注射即可快速实现不同回路的特异性基因操作，适用于多种神经回路研究。

可扩展性强：除了 Cre 重组酶，该系统还可用于表达其他功能蛋白（如钙指示剂 GCaMP7f、光敏感通道 ChR2），实现回路特异性的神经活动监测或光遗传学调控（如研究中同时用该系统表达 GCaMP7f 监测 PFC-BLA 回路钙信号）。

总结

从分子、细胞、行为学层面检测 Shank3 敲除效果，分子水平通过 RT-PCR 和 Western Blot 验证 PFC-BLA 回路中Shank3 mRNA 与蛋白表达降低；

细胞水平借助共聚焦 3D 重建分析神经元形态异常（树突数量减少、树突棘密度增加等）；

通过全细胞膜片钳记录 mEPSC/mIPSC 验证突触传递失衡（兴奋性增强、抑制性减弱）；

可结合行为学水平例如：利用圆形社交场域（RSA）测试观察社交缺陷（总嗅探时间、S 区停留时间等指标降低）；

注意需要同时设置多重对照（单独注射病毒组、野生型注射组等）排除干扰。

文献引用：

• Kim S, Kim YE, Song I, Ujihara Y, Kim N, Jiang YH, Yin HH, Lee TH, Kim IH. Neural circuit pathology driven by Shank3 mutation disrupts social behaviors. Cell Rep. 2022 Jun 7;39(10):110906. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110906. PMID: 35675770; PMCID: PMC9210496.

• Bey AL, Wang X, Yan H, Kim N, Passman RL, Yang Y, Cao X, Towers AJ, Hulbert SW, Duffney LJ, et al. (2018). Brain region-specific disruption of Shank3 in mice reveals a dissociation for cortical and striatal circuits in autism-related behaviors. Transl. Psychiatry 8, 94. 10.1038/s41398-018-0142-6.

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