Int J Biol Macromol-IF8.5 | 药食同源薏苡仁种子外囊泡可治疗溃疡性结肠炎

大家好，今天分享一篇在著名期刊International Journal of Biological Macromolecules上发表“Emerging nutritional potential of edible-medicinal homologous coix lacryma-jobi seed-derived exosomes for treatment of ulcerative colitis”的研究论文。

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植物来源的外泌体因其对多种炎症性疾病的显著治疗潜力而引起了广泛的研究兴趣。本研究从薏苡仁种子中分离出外泌体（CLS-Exos），并系统评估了其在溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中的治疗效果。通过密度梯度离心成功分离出CLS-Exos，获得的颗粒平均直径为157 nm，zeta电位为-0.098 mV。这些CLS-Exos表现出优异的生物相容性，并能有效抑制活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和关键促炎细胞因子的产生。值得注意的是，CLS-Exos处理显著下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，同时上调抗炎介质IL-10和细胞保护酶血红素氧合酶-1（HO-1）。因此，CLS-Exos给药改善了DSS诱导的结肠炎主要症状，包括体重减轻、疾病活动指数（DAI）增加、结肠缩短和结肠黏膜组织病理学损伤。总之，这些发现表明CLS-Exos通过调节炎症反应，将平衡从促炎状态转变为抗炎和修复状态，从而减轻实验性结肠炎。

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溃疡性结肠炎（UC）是慢性炎症性肠病（IBD）的主要形式，造成重大且日益增长的全球健康负担。UC的病理特征包括弥漫性、表浅性和连续性黏膜炎症。UC的确切病因和发病机制仍不完全清楚。它被认为是由遗传易感性、免疫失调和环境因素的复杂相互作用引起的。已确定的风险因素包括阳性家族史、慢性吸烟和高脂肪饮食。常见的临床表现包括腹泻、腹痛和便血（大便带血）。在严重情况下，该疾病可导致严重并发症，如肠穿孔、危及生命的出血，以及长期结直肠癌风险增加。UC通常呈复发缓解型病程。这种慢性和不可预测的性质显著损害患者的生活质量，在最严重的表现中可能危及生命。

UC的异质性和复杂性给临床管理带来了重大挑战。目前的治疗选择有限，主要涉及免疫抑制剂和生物制剂，其中包括已批准的药物，如5-氨基水杨酸（5-ASA）和抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体用于治疗UC。然而，相当比例的患者对可用的药物治疗无效，最终需要手术干预。

外泌体是由各种植物和动物细胞分泌的纳米级囊泡，在细胞间通讯中发挥关键作用。它们作为天然纳米载体的固有特性赋予了优异的生物相容性和组织穿透能力。因此，外泌体具有双重功能：它们不仅是各种治疗化合物的有效递送载体，而且本身也作为内在治疗剂发挥作用。其中，植物外泌体（PENs）因其低毒性和强大的生物活性而引起了显著关注。例如，Deng等人证明口服西兰花来源的外泌体有效改善了模型中的急性和慢性炎症性肠病（IBD）。同样，Huang等人报道生姜衍生的PENs作为UC靶向治疗的有效递送系统。作为一类新型生物活性纳米载体，PENs在UC治疗中显示出相当大的前景。随着研究继续揭示其作用机制，它们的治疗价值日益得到认可。PENs提供了传统疗法和动物源外泌体的有前景替代方案，整合了几个关键优势：固有的生物相容性、可扩展生产、低免疫原性和内在靶向能力，从而为UC治疗提供了新的战略方向。

“药食同源”概念源于传统中医，正在获得全球认可。这一范式强调使用饮食成分进行健康维护和疾病预防，旨在最大限度地减少与长期药物使用相关的潜在不良反应。支持这一概念的是，许多药用植物已显示出抗炎、抗癌和缓解COVID-19后综合征的特性。事实上，饮食干预已被证明能有效管理多种疾病。例如，生酮饮食用于肾脏疾病、精神疾病和中老年人群心血管疾病。这种方法对消化 disorders特别相关，是全球最普遍的健康问题之一。值得注意的饮食策略包括地中海饮食用于儿科胃肠道问题，特定碳水化合物操作用于功能性疾病，以及无麸质饮食用于炎症性肠病（IBD）。

薏苡种子是一种有充分文献记载的药用和食用植物，在传统饮食和医学中已使用数百年。现代证据证实其生物活性化合物的抗癌、抗炎、抗氧化和降血糖活性，支持这种历史用途。特别是从薏苡中分离的特定生物活性成分薏苡素已显示出显著的抗炎特性和低细胞毒性。鉴于薏苡L.种子成分已确立的抗炎功效，我们假设从中衍生的一类新型生物活性纳米颗粒——薏苡种子来源外泌体（CLS-Exos）可能保留并传递这些治疗特性。因此，我们推测CLS-Exos代表一种有前景的新型溃疡性结肠炎治疗候选物。我们的结果表明，CLS-Exos通过显著下调关键促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达来改善溃疡性结肠炎。据我们所知，本研究首次报道CLS-Exos的成功提取及其在UC管理中的治疗应用。总之，这些发现确立CLS-Exos作为一种有前景和有效的UC治疗剂。CLS-Exos的提取及其对UC的影响如图1所示。

3.1. CLS-Exos的表征

对CLS-Exos的理化性质进行了全面表征。动态光散射（DLS）显示平均 hydrodynamic直径为157±2.828 nm，zeta电位为-0.098±0.262 mV（图2A-B）。虽然近中性zeta电位可能表明合成纳米颗粒的不稳定性，但低多分散指数（PDI为0.13）表明单分散分布，暗示在测量条件下的胶体稳定性。这种现象与生物衍生纳米颗粒一致，可能归因于其复杂的表面组成和储存缓冲液的离子强度。透射电子显微镜（TEM）形态学检查证实存在均匀的杯状囊泡，直径约为150 nm（图2C）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）证实了尺寸分布并提供了颗粒浓度数据（图2D）。

通过多个独立批次验证了提取方案的重现性（图2N）。代谢组学分析在CLS-Exos中鉴定出36种不同的脂质种类（图2E），主要包括甘油三酯（TG，22.5%）、神经酰胺（CER，13.1%）、己糖基神经酰胺（Hex1Cer，8.7%）和心磷脂（CL，9.7%）（图2F）。小RNA测序显示CLS-Exos miRNAs中存在长度依赖性核苷酸偏倚（图2G-H）。较短的miRNA（18-20 nt）富含鸟嘌呤（G:23-25%），而较长的种类（22-25 nt）主要含有腺嘌呤（A:28-32%）和尿嘧啶（U:26-30%）。胞嘧啶（C）在所有长度中均代表性不足（<20%）。值得注意的是，miR-159家族成员，特别是csi-miR159a-3p和gma-miR159e-3p，在表达最高的10种miRNA中占总TPM标准化读数的22-35%（图2I）。miRNA表达谱表现出样品特异性异质性（图2J）。

CLS-Exos1显示双峰分布，具有明显的低表达（中值TPM:120）和高表达（中值TPM:280）群体，表明潜在的功能特化或选择性包装。CLS-Exos2显示右偏单峰分布（中值TPM:95），而CLS-Exos3表现出紧密聚集的谱（中值TPM:130），共同表明95-280 TPM的表达范围。功能注释显示跨数据库（Port、Pram、GO和EggNOG）的多样化基因映射，KEGG通路中的注释较少（图2K）。脂质碳链分析显示双峰分布，在C16（120±15种脂质）和C18（140±12种脂质）处达到峰值（图2L），突出了对膜完整性至关重要的棕榈酸和硬脂酸衍生物的丰度。通过BCA测定确定的蛋白质浓度为12.54μg/mL（图2M）。

3.2. CLS-Exos的生物相容性

通过细胞毒性和血液相容性测定评估CLS-Exos的生物安全性。使用MTT测定在RAW264.7和NCM460细胞上评估细胞毒性。根据ISO 10993-5标准，当细胞活力超过70%时，材料被认为是非细胞毒性的。我们的结果证实，即使在最高浓度的CLS-Exos（3.04×1010颗粒/mL）下，两种细胞系的活力仍保持在该阈值以上（图3B）。

通过将小鼠红细胞与各种浓度的CLS-Exos孵育来评估血液相容性（图3C）。在治疗组中未观察到显著溶血。定量而言，所有CLS-Exos浓度的溶血率保持在5%以下，这是生物材料广泛接受的安全限度。这与阳性对照（0.1% Triton X-100）诱导的完全溶血和阴性对照（PBS）的可忽略背景形成鲜明对比。这些集体发现证明CLS-Exos的优异生物相容性。

为了进一步评估CLS-Exos给药的体内安全性概况，在C57BL/6小鼠中进行了全面的系统评估。在适应期后，给小鼠施用CLS-Exos，之后收集血液和主要器官进行分析。血液生化分析（图3D）和全血细胞计数（图3E-K）。初步安全性评估显示，尽管与对照组相比某些参数观察到微小变化，但所有值仍在既定的生理正常范围内，表明没有临床显著毒性。组织病理学检查进一步证实CLS-Exos的生物安全性。对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等重要器官的苏木精和伊红（H&E）染色显示与对照小鼠组织相比没有结构损伤、炎症浸润或其他病理改变的证据（图3L）。总之，血液学、生化和组织病理学分析的结果表明CLS-Exos在体内表现出良好的安全性。

3.3. CLS-Exos对ROS和NO的清除能力

使用DCFH-DA荧光探针在H₂O₂刺激的RAW264.7巨噬细胞和NCM460细胞中评估CLS-Exos的活性氧（ROS）清除能力。在用H₂O₂诱导氧化应激之前，用不同浓度的CLS-Exos预处理细胞。荧光显微镜成像显示CLS-Exos预处理以剂量依赖性方式有效减弱H₂O₂诱导的两种细胞类型中的ROS生成，较高浓度的CLS-Exos表现出优异的ROS清除活性（图4B-C）。这种定性观察通过定量图像分析得到证实。与表现出最强荧光信号的阳性对照（仅H₂O₂组）相比，CLS-Exos处理组的荧光强度显著降低（图4D-E）。这些结果共同证明CLS-Exos的强效抗氧化活性。

在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中评估CLS-Exos抑制一氧化氮（NO）产生的能力。CLS-Exos处理以剂量依赖性方式显著抑制LPS诱导的NO释放（图4F）。与NO结果一致，培养上清液的酶联免疫吸附测定（ELISA）显示CLS-Exos深刻调节关键炎症介质的分泌。具体而言，促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的产生以剂量依赖性方式显著抑制（图4G-I）。

3.4. CLS-Exos对肠上皮细胞修复的影响

划痕实验表明CLS-Exos以浓度和时间依赖性方式显著增强NCM460肠上皮细胞的迁移（图5A-B）。与对照相比，CLS-Exos处理组的伤口闭合率显著更高，在最高浓度下观察到最明显的效果。这些结果表明CLS-Exos有效促进肠上皮的恢复，表明它们可能促进炎症诱导的黏膜损伤修复的关键机制。

3.5. 口服CLS-Exos在DSS诱导的溃疡性结肠炎中的治疗效果

建立右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的小鼠模型以评估CLS-Exos对溃疡性结肠炎（UC）的治疗效果。给小鼠随意饮用含3% DSS的水7天以诱导结肠炎，然后在第8天恢复正常饮水。在第8至14天，治疗组小鼠每天口服不同浓度的CLS-Exos悬浮液，而对照组接受磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

在整个实验期间监测体重作为关键疾病参数。与健康空白对照相比，DSS模型对照组表现出显著体重减轻。相反，所有CLS-Exos处理组以剂量依赖性方式显示DSS诱导的体重减轻显著减轻（图6B）。高剂量CLS-Exos组显示最明显的保护作用，体重轨迹与模型对照组相比显著接近正常水平。

使用疾病活动指数（DAI）定量评估疾病活动。如图6C所示，DSS模型对照组表现出最高DAI评分，而健康空白对照组在整个研究期间保持最低评分。CLS-Exos处理导致疾病严重程度的剂量依赖性改善，高剂量组显示DAI评分接近健康对照组，低剂量组显示中等保护。

我们进一步评估了对器官重量和结肠形态的影响。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）的分析显示CLS-Exos处理以浓度依赖性方式减轻DSS诱导的器官重量变化，治疗组的器官重量介于健康对照组（最高重量）和DSS模型对照组（最低重量）之间（图6D-H）。

作为结肠炎严重程度的关键指标，结肠长度评估显示平行趋势（图6I）。DSS模型组表现出显著的结肠缩短、壁增厚和隐窝结构丧失。这些病理变化通过CLS-Exos处理显著改善，特别是在高剂量组，其维持的结肠长度和结构与健康对照组相当（图6J）。总之，这些发现表明CLS-Exos对DSS诱导的溃疡性结肠炎具有强效、剂量依赖性的治疗效果。

3.6. CLS-Exos治疗后体内炎症因子表达

通过H&E染色对结肠组织进行组织病理学分析，以评估黏膜损伤程度和CLS-Exos的治疗效果（图7A）。与空白对照组中观察到的健康结构相比，3% DSS诱导模型组的结肠切片显示严重的病理改变，包括广泛的炎症细胞浸润、隐窝扭曲和丧失，以及杯状细胞耗竭。

CLS-Exos处理对这些DSS诱导的组织病理学损伤具有浓度依赖性保护作用。高剂量CLS-Exos组显示结肠结构几乎完全保存，炎症浸润最小，隐窝维持良好。杯状细胞的定量证实了这种修复效果，其显示与施用的CLS-Exos浓度显著正相关（图7B）。相反，低剂量组显示与DSS模型对照组相似的组织学特征，表明低浓度时疗效有限。

为了阐明CLS-Exos在结肠炎中的治疗机制，我们分析了全身和局部炎症反应。ELISA血清分析显示CLS-Exos处理显著调节关键炎症细胞因子的全身水平。DSS模型组表现出最高浓度的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，而CLS-Exos给药导致其水平的剂量依赖性降低，接近健康对照组中观察到的水平（图8A-C）。

结肠组织的定量PCR（qPCR）分析在转录水平显示一致变化。促炎介质（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表达随着CLS-Exos处理以浓度依赖性方式降低（图8D-F）。相反，抗炎和细胞保护基因（包括IL-10和血红素氧合酶-1（HO-1））的表达以剂量依赖性方式相应增加（图8G-H）。总之，这些结果表明CLS-Exos通过全身和局部恢复免疫稳态，有效抑制促炎信号，同时促进抗炎和保护途径，从而改善实验性结肠炎。

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