姜红、王平、曹丹、徐洋、James. Qun Wang等应用多模态解析复发/难治DLBCL的单细胞图谱

弥漫大 B 细胞淋巴瘤（ diffuse large B-cell lymphoma ， DLBCL ）是常见 的 侵袭性非霍奇金淋巴瘤，具有高度异质性和临床预后差的特点。尽管 R-CHOP 方案是 DLBCL 的一线标准治疗，但仍有超过三分之一的患者出现复发或对治疗耐药，复发 / 难治性 DLBCL 的总体预后极差。如何寻找有效的预测标志物、改善复发机制下的免疫抑制微环境，是临床和科研急需解决的重大问题。

DLBCL 的复发与耐药与其免疫抑制性微环境密切相关。大量研究发现，复发 / 难治性 DLBCL 患者往往伴随免疫效应细胞功能低下，同时免疫抑制细胞显著富集，导致抗肿瘤免疫被持续削弱。与此同时，恶性 B 细胞通过激活关键信号通路，进一步放大抑制性分子的表达，阻碍 T 细胞等免疫效应细胞的增殖与活化，从而形成持续的免疫抑制状态。这一机制被认为是 DLBCL 复发或 耐药的重要原因。然而，关于复发过程中免疫微环境如何被逐步重塑，仍缺乏系统性的解析 。

近日，四川大学华西医院生物治疗全国重点实验室姜红教授、王平副研究员与华西医院曹丹教授，联合浙江大学徐洋教授以及浙江大学爱丁堡大学联合学院JamesQunWang教授等合作，在Chinese Medical Journal（中华医学杂志英文版）发表了题为Multimodal profiling identifies CD4+CXCR5+PD-1–Tfhcells as prognostic and predictive biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma的研究论文。

该研究综合利用单细胞RNA测序、DNA测序、多重免疫组化（ mIHC ）、动物模型及深度学习技术，对弥漫大B细胞淋巴瘤（ DLBCL ）的肿瘤细胞与免疫微环境进行了系统性的多模态解析。研究首先绘制了初治与复发/难治DLBCL的单细胞图谱，发现CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻滤泡辅助性T细胞（ Tfh1 ）在复发/难治性患者中显著减少。基于此，研究提出CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻ Tfh1细胞可作为DLBCL新的预后与预测生物标志物。此外，团队还基于人工智能开发了mIHC图像生成技术，为临床高效检测与个体化治疗指导提供了潜在的新工具。

图 1. a . 实验流程概述 : 本研究从 68 例接受 R-CHOP 方案治疗的 DLBCL 患者中筛选出 51 例纳入分析。 b . DLBCL 单细胞图谱 - 跨数据集整合的 UMAP 空间分布 ； c . 研究队列 UMAP 注释图谱（标注主要细胞类型） 。

研究首先绘制了 初治 与复发 / 难治 DLBCL 的单细胞图谱，发现 CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻ 滤泡辅助性 T 细胞（ Tfh1 ） 在复发 / 难治性 DLBCL 中显著缺失。进一步分析表明，这一细胞亚群的存在与良好预后和 R-CHOP 应答密切相关。机制研究揭示，复发肿瘤中的恶性 B 细胞可通过 激活 TNF-α/NF- κB 信号通路 抑制 Tfh1 细胞功能，从而导致免疫逃逸和疾病进展。

图 2 . a . 基于 UMAP 的 DLBCL 肿瘤微环境 T/NK 细胞亚群空间分布 ； b . 基于 UMAP 的 DLBCL 肿瘤微环境中 T/NK 细胞亚群空间分布及样本分组 ； c . DLBCL 肿瘤微环境中 CD4 ⁺ T 细胞频率的组间差异分析 。

临床样本验证显示， 肿瘤微环境中 高水平 Tfh1 细胞浸润的患者具有更长的总体生存期，并对 R-CHOP 方案更敏感；而低水平 Tfh1 细胞的患者则更易复发，疗效不佳。为解决临床检测难题，研究团队还开发了一种基于生成对抗网络（ GAN ）的图像预测方法，可利用常规 DAPI 图像预测 mIHC 结果，从而高效识别 Tfh1 细胞，提升了临床应用可行性。

这些发现提出 CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻ Tfh1 细胞 可作为 DLBCL 新的预后与预测生物标志物，同时，团队开发的 AI 模拟 mIHC 技术，有望实现临床高效检测并指导个体化治疗。

弥漫大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ）是常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤，其临床异质性极高，尽管 R-CHO 方案显著改善了部分患者的预后，但仍有约 30 - 40% 的患者出现复发或难治性疾病，提示对 DLBCL 免疫逃逸机制的深入理解仍存在巨大需求。 DLBCL 微环境中， T 细胞耗竭及辅助性 T 细胞（ Tfh1 ）缺失被认为是肿瘤免疫逃逸的重要因素，但其分子和空间机制尚未系统阐明。基于课题组在肿瘤免疫微环境的 探索 ，我们提出 DLBCL 患者中 CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻ Tfh1 细胞的缺失，可能通过调控 B 细胞和 CD8⁺ T 细胞间的信号网络，促进肿瘤的免疫抑制微环境形成，从而加速疾病复发。在实验过程中，团队面临了多方面挑战。例如，淋巴瘤组织中 没有明显的肿瘤区域和间质区域的区分， T 细胞亚群空间分布不均，导致多色免疫荧光（ mIHC ）和空间组学分析难以获得高信噪比数据。为此，优化了组织切片固定与抗体复染流程，并 结合 单细胞及空间转录组分析，以保证 结论 的可重复性和可靠性。此外，我们结合流式细胞分析、体外共培养及机制实验，验证了 Tfh1 细胞缺失与 CD8⁺T 细胞耗竭及关键信号通路激活之间的因果关系。

本研究创新性： 1 ） 概念创新性 ：提出 Tfh1 缺失可作为 DLBCL 复发的预测因子，并揭示其免疫调控机制； 2 ） 研究系统性 ：整合空间组学、单细胞测序和功能验证实验，形成从机制到临床相关性的完整证据链； 3 ） 临床转化价值 ：开发了一种基于生成对抗网络（ GAN ）的图像预测方法，可利用常规 DAPI 图像预测 mIHC 结果。

当然，本研究仍存在局限性： 1 ）机制层面， Tfh1 缺失与特定信号通路的调控网络仍需进一步解析； 2 ）模型系统方面，小鼠模型与人类 DLBCL 在免疫微环境上仍存在差异。针对这些问题，我们计划通过构建人源化模型、开发患者来源淋巴瘤类器官系统等策略，深入探索临床转化潜力。

原文链接：https://journals.lww.com/cmj/fulltext/9900/multimodal_profiling_identifies_cd4_cxcr5_pd_1_.1750.aspx

专家点评

余岩 ，教授，博士生导师，四川大学生命科学学学院

姜红 教授 团队在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）免疫微环境研究领域取得重要突破。该研究通过多模态分析技术，首次明确CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁻ Tfh 细胞作为DLBCL的预后与预测生物标志物，并创新性地开发了基于条件生成对抗网络的智能病理诊断方法。研究团队构建了端到端的Pyramid pix2pix-cGAN模型，能够直接从DAPI染色图像生成高质量的多重免疫组化（ mIHC ）图像，显著降低了传统 mIHC 的技术门槛和资源消耗。该模型在验证集中达到0.86的准确率和0.68的召回率，成功实现了CD4⁺Tfh1细胞的精准识别。相较于传统细胞分类算法，这一方法突破了手动特征提取的局限，通过自适应监督块匹配损失函数保证了像素级图像生成质量。该技术的临床转化价值尤为突出，在资源有限地区，仅需常规DAPI染色即可获得关键免疫细胞浸润数据，为DLBCL的精准分疗提供支持。未来结合多组学数据验证，有望基于该工作构建全自动诊断系统，最终推动淋巴瘤精准诊疗体系的革新。

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